העשרה סלקטיבית ובידוד של חיידקים ימיים מפרקים נפט מדגימות מי ים

תקציר

מקור: וילה, ה. ד. מ. ואחרים. חיפוש זנים מיקרוביאליים לביורימדיאציה ופיתוח פרוביוטיקה למחקר ושימור מטאורגניזמים. J. Vis. Exp. (2019)

סרטון זה מדגים את הבידוד הסלקטיבי של חיידקים ימיים המפרקים נפט על ידי העשרת דגימות מי ים על מדיום מבוסס נפט, מה שמאפשר השחזור של זנים טהורים עם יישומים פוטנציאליים בביורימדיציה של נפט גולמי ובניקוי סביבתי.

פרוטוקול

1. איסוף ואחסון מים ואלמוגים לבידוד מיקרוביאלי

הערה: חשוב לקחת את הקואורדינטות והטמפרטורה של אתרי הדגימה. אם אפשר, מטא-נתונים כמו מליחות, pH, עומק ועוצמת אור יכולים גם הם לסייע במציאת גישות טיפוח מכוונות ופרשנות עתידית של נתונים. לתוצאות אמינות, שמרו את הדגימות מאוחסנות למשך הזמן המינימלי האפשרי. המיקרוביום של מים/אלמוגים עשוי להשתנות משמעותית אם הדגימות לא נשמרות בטמפרטורה הנכונה ו/או נשמרות לפרקי זמן ארוכים. אם שלב הבידוד לא מתבצע מיד לאחר האיסוף, חשוב לשמור על דגימות בטמפרטורה של 4°C עד לעיבוד. ככל שהדגימות נשמרות זמן רב יותר, אפילו בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס, כך הקהילה המיקרוביאלית תשתנה.

1. לדגום ולאחסן את מי הים.
   1. אסוף 500 מ"ל דגימות מים לפחות בשלושה עותקים מכל אתר דגימה ממוקד. עדיף להשתמש בבקבוקים סטריליים עם פקקי ברגים.
   2. אם מעבדים את המים מיד לאחר האיסוף, שמרו את הבקבוקים בטמפרטורת החדר (RT) לפרק זמן קצר. אם עיבוד הדגימה מתבצע מאוחר יותר, שמור על הבקבוקים בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס.
2. דגמו ואחסנו את האלמוגים.
   1. השתמש בזוג פליירים סטריליים כדי לחתוך שברי אלמוגים מאותו אתר דגימה כמו דגימות המים. כדי למנוע זיהום, נגעו באלמוגים רק עם כפפות סטריליות.
   2. שטוף את שבר האלמוג שנדגם באמצעות תמיסת מלח סטרילית של 20 מ"ל (3% NaCl (כלוריד נתרן) במים מזוקקים) או מי ים מלאכותיים כדי להיפטר מהחיידקים החופשיים המחוברים ברפיון של מי הים.
   3. באמצעות מלקחיים, מניחים כל שבר אלמוג במיכל סטרילי בנפח 250−500 מ"ל עם מכסה בורג המכיל תמיסת מלח סטרילית.
   4. במעבדה, באמצעות מלקחיים סטריליים ופליירים, שוקלים 5 גרם של שברי אלמוגים באמצעות צלחות פטרי סטריליות בגודל 100 מ"מ על 20 מ"מ על משקל שקילה.
   5. העבר את 5 גרם דגימת האלמוגים למכתש סטרילי ומרסר אותו באמצעות עלי סטרילי.
   6. באמצעות מרית סטרילית, העבר את הדגימה המרוסנת לבקבוק תרבית סטרילי המכיל 45 מ"ל של תמיסת NaCl סטרילית של 3% ו-10−15 חרוזי זכוכית של 5 מ"מ. השתמשו בתמיסת מלח סטרילית של 45 מ"ל כדי לשטוף את המלט ולהחזיר את הכמות המקסימלית של המצראט.
   7. שמור על הבקבוקים תחת ערבוב קבוע (150 x גרם) במשך 16 שעות בטמפרטורת המים של אתר הדגימה.
      הערה: עבור אלמוגים במים רדודים, הטמפרטורה האופטימלית תנוע בין 24−28 מעלות צלזיוס. שלב זה יפריד מיקרואורגניזמים מתאי אלמוגים שונים, כגון אלה שמחוברים לתאי המארח, או אלה החיים בתוך הרקמה והשלד. לאחר שלב זה, אין לאחסן את המצרטים האלמוגיים, ושלב הבידוד חייב להתבצע מיד.

2. בידוד חיידקים מפריקי שמן ממי ים ו/או אלמוגים

1. הכינו מדיום מינימלי המכיל שבר מסיס במים בשמן (oWSF) וחלק בלתי מסיס במים (oWIF) כמקור הפחמן היחיד.
   1. הוסיפו 1−2% נפט גולמי ל-500 מ"ל מים מזוקקים סטריליים. השתמש בבקבוק מסנן פתוח בתחתית כדי להוציא את השבר המסיס מבלי להפריע לשכבה העליונה של החלק הבלתי מסיס.
   2. שמור על התערובת בערבוב קבוע בטמפרטורה של 24−28 מעלות צלזיוס ב-150 x גרם למשך 48 שעות.
   3. הנח את בקבוק המסנן המכיל את חלקי הנפט הגולמי על משטח יציב והמתן 10−20 דקות כדי לאפשר הפרדה בין חלקים מסיסים ובלתי מסיסים.
   4. העבר את ה-oWSF לבקבוק סטרילי חדש, תוך שמירה על ה-oWIF על ידי פתיחת הבקבוקון התחתון והוצאת השבר המסיס.
   5. באמצעות כל ה-oWSF שהוחזר בשלב הקודם (~400 מ"ל), הכינו 1 ליטר של מדיום מינימום אגר BH (בושנל האס) המכיל oWSF כמקור הפחמן היחיד.
   6. באמצעות ה-oWIF שנותר בבקבוק מהשלב 2.1.4, הכינו 1 ליטר של מדיום מינימלי של אגר BH המכיל oWIF כמקור הפחמן היחיד.
2. בודדו חיידקים שמפרקים oWSF ו-oWIF.
   1. באמצעות מים ומרצה אלמוגים מהשלבים 1.1.2 ו-1.2.7, בהתאמה, מדלל את הדגימות עד ^10-6 בתמיסת מלח סטרילית כפי שמופיע להלן.
3. בצע דילול סדרתי עד ^10-9 בתמיסת מלח סטרילית לדגימות אלמוגים ועד ^10-6 לדגימות מים. פיפט מדלל פי 5 למעלה ולמטה לפני שמשליכים את הקצה. דגימת Vortex במשך 5 שניות בכל פעם לפני ביצוע הדילול הסדרתי הבא.
4. פיפט 100 מיקרוליטר מכל דילול על צלחות פטרי המכילות מדיום אגר BH-oWSF ו-BH-oWIF וצלחו אותם.
5. דגרו את הלוחות למשך 1−3 ימים בטמפרטורת היעד (למשל, 26 מעלות צלזיוס). בדוק את הלוחיות פעם ביום.
6. בחר ובודד את המושבות המציגות מורפולוגיות גדילה מובחנות על לוחות חדשים באמצעות טכניקת לוחות הפסים. חזור על השלב הזה כמה פעמים שצריך כדי לגדול מושבות טהורות על הלוחות.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה

שם	חברה	מספר קטלוג	הערות
בקבוק אחסון מדיה PYREX בנפח 500 מ"ל	תומאס סיינטיפיק/קורנינג	1743E20/1395-500	משמש לטעימת מים.
בקבוקי שאפירטור בנפח 500 מ"ל	תומאס סיינטיפיק/קורנינג	1234B28/1220-2X	משמש להפרדת חלקי השמן.
פלייר חותך חוט בקוטר 6 אינץ'	תומאס סיינטיפיק/רסטק	1173Y64/23033	שימש לחיתוך שברי אלמוגים.
אגר	הימדיה	PCT0901-1 ק"ג	שימש לייצור מדיה מוצקה.
בושנל האס בור	הימדיה	M350-500G	משמש כמדיה מינימלית להשלמת מקורות פחמן.
פלאסק ארלנמאייר	תומאס סיינטיפיק/DWK מדעי החיים (קימבל)	4882H35/26500-125	משמש לדגירה של אלמוגים עם חרוזי זכוכית.
מכסה זרימה למינרי			הייתי צריך לעבוד בתנאים סטריליים.
לוריה ברטאני ברוט, מילר (מילר לוריה ברטאני ברוט)	הימדיה	M1245-1KG	משמש כמדיה עשירה לגידול חיידקים.
מרין אגר 2216 (זובל מרין אגר)	הימדיה	M384-500G	משמש כמדיה עשירה לגידול חיידקים.
חממת מנערת אורביטל			משמש לדגירת מדיה נוזלית ושמן.
חממת לוחות			משמש לדגירת צלחות.
מרגמה ועלי פורצלן	תומאס סיינטיפיק/יונייטד סיינטיפיקס	1201U69/JMD150	משמש להפסקת שברי אלמוגים.
צנטריפוגה מקוררת			משמש לצנטריפוגות תרביות חיידקים.
ספקטרופוטומטר			משמש למדידת צפיפות אופטית של תרביות חיידקים.
ערכת טיהור DNA גנומי של Wizard	פרומגה	A1120	משמש למיצוי DNA של זנים מיקרוביאליים.