מעקב אחר צמיחת חיידקים ברזולוציית תא יחיד במערכת מיקרופלואידית

תקציר

מקור: קאבין, מ. ט. ואחרים. ניתוח מיקרופלואידי חד-תאי של Bacillus subtilis. J. Vis. Exp. (2018)

הסרטון מדגים את השימוש במכשיר מיקרופלואידי לצפייה בצמיחת חיידקים ברמת התא היחיד. הוא מראה כיצד תאי חיידקים לא ניידים, הכלואים בתעלות בקנה מידה מיקרו, מוזנים ומתוחזקים באופן רציף תחת מיקרוסקופ פלואורסצנטי. ההגדרה מאפשרת ויזואליזציה בזמן אמת של חלוקת תאים ומעקב אחר שושלת לאורך דורות שונים.

פרוטוקול

1. יציקת התקנים ב-PDMS

1. בסביבה ללא אבק, יש לערבב פולימר פולידימתיל סילוקסן (PDMS) עם חומר התייבשות ביחס של 10:1 ולדה-גז בוואקום למשך לפחות 10 דקות.
2. הניחו סיליקון מאסטר (או העתק של אפוקסי או פוליאוריתן) על חתיכת נייר אלומיניום שלמה בתוך פלטת פטרי מפוליסטירן. שפוך את תערובת ה-PDMS המופרקת מעל המאסטר לעומק של כ-5 מ"מ. דהרו את פלטת הפטרי לפחות 10 דקות. השתמש בזרם אוויר עדין כדי לשבור בועות על פני השטח.
   הערה: מאסטר רפליקה מפלסטיק עשוי לצוף חלקית במהלך הגז; אם זה קורה, דחפו את הרפליקה למטה עם אפליקטור פלסטיק נקי.
3. מקבשים PDMS לפחות שעה בתנור בטמפרטורה של 60 מעלות צלזיוס וקרר לטמפרטורת החדר. הסר את נייר האלומיניום המכיל את ה-Master ו-PDMS המיובש מפלטת פטרי. קילף בזהירות את נייר האלומיניום מאחורי המאסטר, ואז קלף בזהירות את ה-PDMS מהמאסטר.
   הערה: לחילופין, ניתן לרפא את PDMS במהלך הלילה בטמפרטורת החדר. השבריריות היחסית של מאסטר וופר סיליקון ניתן להתגבר על ידי שימוש בדבק אפוקסי לקישור קבוע של הווייפר לדיסק אלומיניום בעובי 1/16 אינץ' באותו גודל כמו הוופר.
4. מכיוון שווייפר בדרך כלל כולל מספר מכשירים מיקרופלואידיים במידות מעט שונות, חתכו מכשיר אחד לגודל באמצעות סכין נקייה וחדה.
   הערה: לעבודה שגרתית עם Bacillus subtilis , השתמשו במכשירים עם תעלות תאים ברוחב 1.0 מיקרון.

2. ניקוב וחיבור מכשירים

1. הניחו חתיכת סרט משרדי שקוף (ראו טבלת חומרים) מעל הצד המעוצב של המכשיר כדי לשפר את הנראות של התכונות המעוצבות. פתחי הכניסה והיציאה מזוהים כאזורים מעגליים בקצוות מנוגדים של התעלות הנוזליות הנראות (איור 1). כדי לשפר את הנראות שלהם בעת חורים במכשיר לפיני הכניסה והיציאה, סמן את הכניסות והיציאות בנקודות באמצעות טוש דק.
   הערה: כדי להבטיח שפיני הכניסה והיציאה אינם צפופים, כל שאר הערוצים מנוקבים, החל מהערוץ שמתחת לסמן האלפביתי של המכשיר.
2. הפוך את מכשיר ה-PDMS כך שהצד המעוצב יהיה כלפי מטה, ומחורר דרך המכשיר לנקודות המסומנות באמצעות מחורר ביופסיה בקוטר 0.75 מ"מ; זרוק את הניקובים.
   הערה: המכשירים מנוקבים כאשר הצד המעוצב כלפי מטה, משום שהחור שנוצר על ידי החור בדרך כלל מורחב מעט במקום שבו החור נכנס לפולימר. ניקוב המכשיר בכיוון הפוך מבטיח שלחור בצד המעוצב יש מסגרת חדה.
3. באמצעות סטריאומיקרוסקופ, ודא שהחורים המחוררים חופפים לאזורי הכניסה והיציאה של המכשיר. השתמש במלקשים דקים כדי להסיר שברים מיותרים של PDMS מהחורים המחוררים.
4. השתמש בדבק דבק כדי להסיר אבק משני צידי המכשיר ולהכניס אותו לפלטת פטרי פוליסטירן נקייה. הכינו כיסוי בגודל 22 מ"מ על 40 מ"מ על ידי הרטבה עם אלכוהול איזופרופיל 100% ושפשוף עם מגבון חדר נקי; יבש עם זרם של אוויר ללא אבק או חנקן.
5. הניחו את מכשיר ה-PDMS המנוקב בצד כלפי מעלה יחד עם הזכוכית הנקייה לתוך מנקה פלזמה של חמצן.
   1. טיפול בפלזמה במכשיר עם ההגדרות הבאות: ואקום, 70 mTorr; לחץ O₂, 200 mTorr; משך, 15 שניות; הספק, 30 וואט. מיד לאחר סיום תקופת הטיפול בפלזמה, הסר את המכשיר וכסה את הזכוכית ממנקה הפלזמה.
   2. הפוך את ה-PDMS והניח אותו במרכז זכוכית הכיסוי כך שהצד המעוצב ייגע בזכוכית; ודא שערוצי ההזנה (הרצים בין אזור הכניסה ליציאה) מיושרים עם הציר הארוך של זכוכית הכיסוי. לחץ בעדינות רבה כדי לוודא שה-PDMS אוטם מול הזכוכית.
6. אפו את המכשיר המורכב בתנור לפחות שעה אחת בטמפרטורה של 60 מעלות צלזיוס. לאחר האפייה, ודאו ידנית שה-PDMS מחובר לזכוכית על ידי לחיצה עדינה על פינה אחת של המכשיר.
   הערה: לאחר שהמכשיר מחובר, יש להשתמש בו תוך 24 שעות, שכן הפולימר יהפוב יותר ויותר עם הזמן שלאחר טיפול בפלזמה.

3. הכנת אינסטלציה מיקרופלואידית

1. חתכו אורכי צינור פולימר (קוטר פנימי (ID) 0.02 אינץ', קוטר חיצוני (OD) 0.06 אינץ') לאורך המתאים שיגיעו ממשאבת המזרק למכשיר המיתוג (אם משתמשים בו) ולמכשיר כאשר מותקנים על המיקרוסקופ. חתוך כמה אורכים שיש מסלולי מיקרופלואיד.
2. הרכיבו חיבורי Y לשסתומי צביטה (אם משתמשים בהם) על ידי חיתוך וחיבור צינורות סיליקון גמישים באורך 2 ס"מ (0.03 אינץ' ID, 0.065 אינץ' OD) לקוצים העליונים של ה-"Y" ואורך של צינור סיליקון באורך 1 ס"מ לקוצים התחתונים של ה-"Y".
3. לחתוך אורך של 10 ס"מ (או מתאימים) של צינורות פולימר; מחברים אותם בקצה אחד לצומת המתג על ידי הכנסתם לקטעי צינור הסיליקון בקוטר 1 ס"מ בקוטר התחתון של ה-"Y". חבר אותם בקצה השני למחטים 21G שהוסרו ממתאמי המזרק הפלסטי שלהם והתעקמו בכ-90° כ-9 מ"מ מקצה המחט.
4. חבר מחטים קהות 21G לקצה אחד של מקטעי הצינור שיעברו מהמזרקים למכשיר המתג על ידי הכנסת המחטים לצינור. הכנס את הקצוות האחרים של כל אורך צינור לתוך מקטעי הצינור הסיליקוני על סיכות הכניסה של מחברי ה-Y.
   הערה: השתמש במכשיר כלשהו כדי להחזיק את שסתומי הצמידה והחיבורים במקומם; ניתן להכין זאת בקלות מקופסת קצה מיקרופיפטה (איור 2D).
5. חתכו קטעים של צינורות פולימר כדי להעביר פסולת מיציאת המכשיר לבקבוק הפסולת. חבר אותם בקצה אחד למחטים מעוקלות של 21 G, שהוכן כפי שתואר לעיל. הדביקים את הקצה השני של הצינורות לתוך פסולת.
6. הכינו נפחים מתאימים של מדיום המכיל 0.1 מ"ג/מ"ל אלבומין סרום בקר (BSA) ומלאו את הגודל ומספר המזרקים הרצויים. חבר את המזרקים הטעונים ב-BSA למחטים המוכנות של 21G המחוברות לצינור הכניסה והטעין את המזרקים למשאבות מזרק.
   הערה: בניסויים טיפוסיים משתמשים בחמישה ערוצים של המכשיר, כל אחד עם מזרק בנפח 20 מ"ל. ניסוי שבו המדיום מוחלף ידרוש 2 בנקים של 5 מזרקים כל אחד. כאן, המשאבה המכילה את הבנק הראשון נקראת משאבת פאזה-1, והמשאבה המכילה את הבנק השני, עם מדיום הפוסט-מתג, נקראת משאבת פאזה-2.
7. פינוי אוויר מצינור הכניסה על ידי הפעלת משאבות המזרקים בקצב זרימה גבוה (>500 מיקרוליטר/דקה), החל בכיוון אנכי של משאבות המזרקים והקשה על המזרקים כדי להגיש בועות אוויר למעלה. לאחר שהאוויר נוקה מהמזרקים, הניחו את משאבת המזרק אופקית והקישו בהדרגה או העבירו את קווי הפולימר מהמזרקים למעלה דרך מתקן המתג כדי לשחרר ולנקות בועות אוויר. חזור על התהליך הזה עבור מאגר המזרקים השני (אם מחליפים מדיה).
8. לאחר טיהור בועות האוויר, כוון את משאבת המזרק פאזה-2 (כלומר, עם המדיום שישמש שני, אחרי המתג) ל-1.5 מיקרוליטר/דקה, ואז עצרו את הזרימה. הניחו קליפסים קטנים על מקטעי הצינור הגמיש בענף הצמתים Y התואמים לשלב הבינוני השני. המשך להפעיל את משאבת המזרק פאזה-1 בקצב זרימה מתון (למשל, 10 מיקרוליטר/דקה) לפחות 30 דקות כדי לפנות את המדיום השני מצינור הכניסה במורד צומת ה-Y.

4. הכנת תרבית תאים

1. גדל פרה-תרבות של הזן הרצוי במדיום הרצוי בן לילה, ועד לשלב הנייח. הזן החיידקי צריך להכיל מוטציה שהופכת את התאים לבלתי ניידים, כך שהתאים לא ישחו מחוץ לתעלות המכשיר.
   הערה: בפרוטוקול זה, הזן החיידקי הוא B. subtilis 3610 המכיל החלפת HagA233V (מוטציה זו גורמת לפלוג'לום להיות ישר במקום הליקלי, מה שמונע תנועתיות תא), מדווח PrsbV-mNeonGreen ללחץ תאי, ומדווח Phyperspank-mNeptune (אדום) מרכיב להדגשת תאים. מדיום לנוקס Luria-Bertani (LB) משמש בפרוטוקול לדוגמה. זנים טיפוסיים לניסויים במיקרופלואידיקה כוללים אחד או יותר מדווחי שעתוק פלואורסצנטיים וחלבון פלואורסצנטי ציטופלזמי המיוצר באופן קבוע, כדי להקל על זיהוי אוטומטי של תאים. פגמי גדילה לא נצפו כאשר השתמשו במדיום עשיר ב-LB Lennox, אך צמיחת B. subtilis במדיה מינימלית עשויה להיות מעוכבת בתנאים מיקרופלואידיים מכיוון שסידרופורים מופרשים נשטפים על ידי זרימת התווך. בנסיבות כאלה, ניתן לשחזר את הצמיחה על ידי הוספת נתרן ציטראט וכלוריד ברזל לתווך, כפי שדווח עבור מדיום S750.
2. בבוקר הניסוי, דיללו את תאי B. subtilis ביחס של 1:50 לבקבוק מבולבל בנפח 250 מ"ל המכיל 25 מ"ל מדיום גידול. גדלו את התאים במשך 5 - 6 שעות בתרבות ניעור בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס לצפיפות אופטית גבוהה מ-1.
   הערה: תרבית תאים צפופה עדיפה כי תאי B. subtilis בשלב נייח קטנים יותר ופחות נמצאים בשרשראות תאים, מה שמקל על טעינת המכשירים. מינים שונים עשויים להזדקק למדיומים אחרים או תנאי גדילה נוספים לעומס אופטימלי.
3. באמצעות מזרק המצויד במסנן בגודל נקבוביות של 5 מיקרומטר, מסנן כ-15 מ"ל תרבית תאים לצינור קונוסי של 15 מ"ל כדי להסיר את שרשראות התאים של B. subtilis (זה אינו נחוץ ל-E. coli וייתכן שלא יהיה נחוץ במינים אחרים).
   הערה: יש להסיר מעט תאים יחסית; הסינון צריך להיות עכור.
4. צנטריפוגה את התרבית המסוננת למשך 10 דקות בעוצמה של 4,000 x גרם בטמפרטורת החדר. שפוך את הסופרנטנט והחזיר את כדור התא לנוזל הסופרנטנט השארי שנותר בצינורת, תוך הוספת כ-500 מיקרוליטר של מדיום טרי במידת הצורך כדי להקל על פיפטינג של תליית התא.

5. טעינת מכשיר

1. הכניסו בעדינות את קצות המיקרופיפטות הדקים והעמוסים בג'ל (ראו טבלת חומרים) בתוך חורי היציאה של מכשיר המיקרופלואידי.
2. באמצעות קצוות דקים עם ג'ל דק עם מיקרופיפט P200, יש להפסיב את המכשיר על ידי הזרקת מדיום המכיל 1 mg/mL BSA לחורי הכניסה, תוך התבוננות בקצוות בחורי היציאה כדי לנטר את מילוי תעלות המיקרופלואיד (איור 2A). דגרו את המכשיר בטמפרטורת החדר למשך כ-5 דקות.
   הערה: BSA משמש לעיתים קרובות כסוכן חוסם או פסיבציה שנקשר לפני השטח ההידרופובי של פולימר PDMS, מה שמגביר את ההידרופיליות שלו ומפחית את הקשר של חלבונים אחרים או של תאים (באמצעות מולקולות משטח התא).
3. באמצעות קצות דקים לטעינה ג'לית, טענו כל ערוץ בתאים שהוחזרו (מסעיף 4), תוך שימוש בקצוות בערוץ היציאה כדי לנטר את התקדמות התאים דרך המכשיר (איור 2B).
   הערה: הטעינה מתבצעת על ידי כוונון המיקרופיפטה P200 לנפח המקסימלי של 200 מיקרוליטר ואז שאיפת כרית אוויר לפני שאיפת נפח קטן (כחצי מנפח החלק הדק של קצה הפיפטה) של תאים. נפח התאים המוחזרים אינו חייב להיות מדויק, שכן נפח מכשיר ה-PDMS קטן יחסית לנפח המיקרופיפטה. איננו יודעים על גבול עליון לצפיפות התאים המוחזרים, כל עוד ניתן להכניס את תליית התא לתוך המכשיר. גושי תאים עלולים לסתום את המכשיר ויש להימנע מהם באמצעות פיפטינג יסודי ו/או ערבוב מערבולת.
4. הסר בעדינות את קצות הג'ל מחורי היציאה, ועבוד אחד אחד כדי למנוע נזק למכשיר.
5. צנטריפוגה את המכשיר במיקרוצנטריפוגה על שולחן במתאם רוטור מתאים בעוצמה של כ-6,000 x g למשך 10 דקות (איור 2C).
   הערה: נעשה שימוש במתאם רוטור אלומיניום מותאם אישית שתוכנן להתאים לרוטור מיקרוצנטריפוגה (איור 2C); ניתן להשתמש בדגמי צנטריפוגות שונים עם מתאמי רוטור מתאימים. המאפיין החשוב של המתאם הוא מספק כוח צדדי בכיוון הקצוות הסגורים של תעלות התא, ובכך דוחף תאים לעבור לתעלות הצד.
6. אימות טעינה מוצלחת תחת המיקרוסקופ (איור 3), אך ללא חיבור המכשיר למחזיק המחסנית/הכנסת הבמה.
   הערה: בפרוטוקול זה, מטרה לטבילה בשמן 60X, 1.4 NA ו-Ph3 משמשת הן לאימות בשלב זה והן להדמיה הבאה.

6. הרכבת מכשירים, איזון והרכבה

1. הרכבו בזהירות את המכשיר הטעון על תוספת במה על ידי הדבקה של זכוכית הכיסוי משני צידי ה-PDMS לתחתית התוספת (כלומר, הפוך את התוספת לפני חיבור המכשיר). הפוך את מכלול התקן ההכנסה של הבמה כך שה-PDMS יהיה פונה כלפי מעלה והניחו אותו על משטח רך, כמו מנגב ללא אבק (איור 2D).
2. כוון את קצב הזרימה של משאבת המזרק פאזה-1 ל-35 מיקרוליטר לדקה. בעבודה עם נתיב אחד בכל פעם, מכניסים את מחט הכניסה ואז את מחט היציאה (כלומר, לרוץ לבקבוק הפסולת; איור 2E).
3. נקה כל עודף מדיום עם מגבון נקי וללא אבק ובדקו את המכשיר ויזואלית לאיתור נזילות. בדוק את צינור היציאה למראה של תאים עודפים (בדרך כלל כפס עכור) ואת המניסקוס הבינוני, שינוע לאט לעבר הפסולת.
4. אפשר למכשיר לפעול במהירות של 35 מיקרוליטר לדקה למשך כ-15 עד 30 דקות, עד שכל הנתיבים המחוברים מתנקזים אל הפסולת.
5. כוון את משאבת המזרק פאזה-1 ל-1.5 מיקרוליטר/דקה והפסיקו את הזרימה. הביאו את כל המשאבה והמכשיר למיקרוסקופ (תהליך זה מסייע על ידי הנחתם על עגלה מתגלגלת) והתחלו מחדש את זרימת המדיום פאזה-1 במהירות של 1.5 מיקרוליטר/דקה. התקן בזהירות את הכניסת הבמה עם המכשיר למיקרוסקופ פלואורסצנציה הפוך, תוך שימוש בסרט הדבק לפי הצורך כדי לנתב את צינור הכניסה והיציאה.
6. מצא את המיקומים הרצויים במכשיר להדמיה והתחל בהדמיה לפי הצורך. יש לשים לב שתאים בדרך כלל זקוקים למספר שעות (כ-10 דורות) כדי להגיע לצמיחה אקספוננציאלית במצב יציב, ותחילת רכישת התמונה עשויה להתעכב לפי הצורך כך שהדימות מתחיל לאחר תקופת האיזון.
   הערה: יש לאמת את הצמיחה היציבה של תאים המוחזקים בפאזה אקספוננציאלית במהלך ניתוח התמונה הבא על ידי מעקב אחר זמני חלוקת התאים והבטחת שהגיעו לערך מינימלי קבוע.

תוצאות

איור 1: סכמטי של מכשיר המיקרופלואידי. סכמת מכשיר מוצגת בקירוב בקנה מידה. הסימון האלפביתי מסומן יחד עם אזורי הכניסה והיציאה שמחוררים כדי לחבר את המחטים הקהות. בדרך כלל משתמשים בחצי מהתעלות המעוצבות (עם גוון אפור). תעלות התאים מכוונות לכיוון ...

חומרים