הערכת תנועתיות חיידקית באמצעות מכשיר מיקרופלואידי

Abstract

מקור: שיידוויילר, ד., ואחרים. שילוב מכשירים נוזליים עם מיקרוסקופיה וציטומטריית זרימה לחקר הובלה מיקרוביאלית במדיה נקבובית בקנה מידה מרחבי. J. Vis. Exp. (2020).

הסרטון הזה מדגים את השימוש במכשיר מיקרופלואידי לכימות תנועתיות חיידקית באמצעות מטריצה נקבובית המורכבת מעמודים מסודרים באקראי. חיידקים מסומנים פלואורסצנטית מוכנסים למכשיר, מצולמים במיקרוסקופיה כשהם נעים דרך המטריצה הנקבובית אל ערוץ התצפית, ומנותחים ליצירת עקומת פריצת דרך (BTC).

Protocol

1. תנאי תרבית חיידקים

1. בעבודה מתחת למכסה זרימה למינרי, השתמשו ב-100 מיקרוליטר מלאי גליצרול של חלבון פלואורסצנטי ירוק (GFP) עם תגית Pseudomonas putida KT2440 (1 ×^{10 7} מ"^ל-1, מאוחסן בטמפרטורה של -80 מעלות צלזיוס) כדי לחליק 5 מ"ל מדיום Luria-Bertani (LB). דגרו ב-30 מעלות צלזיוס תוך כדי ניעור ב-250 סל"ד במהלך הלילה.
2. למחרת, החזירו 100 מיקרוליטר מהתרבית ללילה במדיום של 5 מ"ל ליברליין ודגרו באותם תנאים במשך 5 שעות (שלב מעריכי). דגמו אליקו של 1 מ"ל לתוך צינור של 2 מ"ל, תנו לו להתקרר לטמפרטורת החדר (~15 דקות), ולהשתמש בצנטריפוגה (2300 x גרם למשך 5 דקות).
3. הסר את הסופרנטנט והוסיף 1 מ"ל בופר תנועתיות לכדור. מערבולת לזמן קצר כדי להומוגן את הדגימה. מדלל כדי להגיע לריכוז התא הרצוי, למשל 5 x 10^{5 mL-1}.
4. לניסויים הכוללים קהילות טבעיות, כמו אלו שמקורם בנחלים, יש להכין מדיום גידול לא סלקטיבי. לדוגמה, השתמש במי נחל מסוננים ומאוטוקליים סטריליים או בתווך מים מלאכותי עם מקור פחמן מורכב (מדיום LB).

2. הכנת מכשיר מיקרופלואידי בפולידימתילסילוקסן (PDMS)

1. עיצוב הגאומטריה הנקבובית הרצויה באמצעות תוכנת שרטוט בעזרת מחשב (CAD), הכוללת מטריצה של מעגלים (כלומר, המכשול הבלתי חדיר לזרימה), המתוארת לפי גודל רדיוס וקואורדנטות מרכזיות.
   הערה: דוגמה לגאומטריה נקבובית עם גדלי גרעינים ונקבוביות אקראיים מוצגת באיור 1A. ערוץ תצפית ללא מכשולים בקרבת היציאה מקל על רכישת עקומות פריצת דרך (BTCs).
2. בהתבסס על הגיאומטריה שנבחרה, יש להכין תבנית באמצעות פוטוליתוגרפיה סטנדרטית מסוג SU-8.
   הערה: לחילופין, ניתן להזמין תבניות גם ממתקן מיקרופבריקציה ייעודי. כדי להשיג זרימת נוזלים הטרוגנית במישור האופקי, חשוב לתכנן את עובי תא המיקרופלואידיקה באותו סדר גודל כמו גודל הגרון הממוצע של נקבוביות. עם זאת, ודא שממדי מכשיר המיקרופלואיד מתאימים לתצפית תחת המיקרוסקופ (למשל, עבודה על שקופיות מיקרוסקופ).
3. הכינו 50 גרם PDMS על ידי הוספת 10% מקשר צולב (דימתיל, מתיל-הידרוגן, קופולימר סילוקסן) ל-90% מהאלסטומר לפי משקל, באמצעות מזרק ללא מחט. עבוד בתנאים נקיים והימנע מאבק ככל האפשר. ערבב את שני החומרים במיכל נקי חד-פעמי ומרח ואקום (100 מ"בר) למשך 30 דקות כדי להסיר אוויר מומס ובועות מה-PDMS הצמיגי.
4. הניחו את התבנית בצלחת פטרי (בקוטר 100 מ"מ, גובה 15 מ"מ). שפוך את ה-PDMS על התבנית לגובה הרצוי (למשל, 2-5 מ"מ). כסו את צלחת הפטרי ושמרו על טמפרטורה של 60 מעלות צלזיוס במשך 4 שעות (לילה לשכבות עבות יותר) להתקשות.
   הערה: לצורכי ויזואליזציה, האור אמור להיות מסוגל לעבור דרך ה-PDMS; לכן, שכבה דקה בין 2 מ"מ ל-5 מ"מ רצויה. שכבות עבות יותר (>5 מ"מ) מפחיתות את שקיפות המכשיר, ושכבות דקות יותר נתונות לעיוותים במהלך היישום.
5. הסר את התבנית מהתנור ותן למכשיר המיקרופלואידיק להתקרר לטמפרטורת החדר. לאחר הקירור, הסר בזהירות את החלק הרצוי של PDMS באמצעות סכין מנתח.
   הערה: לחצים חזקים על התבנית גורמים לשברים בעובש. אל תיגע ב-PDMS בידיים חשופות, כי טביעות אצבע ישפיעו על שקיפות אופטית.
6. אטום זמנית את תחתית ערוץ ה-PDMS (שם נחרטה הגיאומטריה הרצויה) עם סרט דבק. עם מחורר ביופסיה בקוטר 0.5 מ"מ, חדור את תעלת המיקרופלואיד ליצירת כניסה ויציאה המתאימים לצינור בקוטר 0.5 מ"מ (קוטר פנימי).
   הערה: האופי הרך של PDMS יבטיח הידוק לאחר הכנסת הצינור. לא ניתן ליצור ערוצי כניסה ויציאה לאחר שה-PDMS נאטם לזכוכית.
7. אטום את ערוץ המיקרופלואיד באמצעות קשר פלזמה של חמצן באמצעות גנרטור בתדר גבוה (קשר פלזמה, טבלת חומרים). לשם כך, נקה זכוכית סיליקטית (25 מ"מ x 75 מ"מ) באתנול ותן לה להתייבש. הסר את הסרט מערוץ ה-PDMS והניח את התעלה כשהצד הנקבובי פונה כלפי מעלה. לטפל במשטחי הזכוכית הסיליקטית ובמשטחי PDMS בפלזמה למשך כ-45 שניות בטמפרטורת החדר.
8. הנח את ערוץ ה-PDMS על מחסנית זכוכית סיליקטית וחמם ב-100 מעלות צלזיוס למשך 30 דקות על פלטת חימום.
9. הסר את המכשיר המיקרופלואידי מהפלטה החמה וקירר אותו לטמפרטורת החדר. חבר את כניסת הערוץ של ה-PDMS עם צינור. מרח ואקום למשך 30 דקות כדי להוציא אוויר מ-PDMS, שהוא כמעט בלתי חדיר לנוזלים אך חדיר לגז.
10. הכינו 100 מ"ל של בופר תנועתיות (10 מ"מ פוספט אשלגן, 0.1 מ"מ אתילנדיאמינטטטראצטית (EDTA), בתוספת 1% עם גלוקוז/וולט, pH 7.0) והזריקו 1 מ"ל ממנו למכשיר המיקרופלואידי באמצעות משאבת מזרק הפועלת ב-10 ^{מיקרו-ליטר min-1}.
    הערה: מכיוון שה-PDMS אינו רווי בגז (בגלל שלב הוואקום הקודם), הבועות ייעלמו תוך ~30 דקות.

3. ניתוח הובלה של חיידקים באמצעות מכשירי מיקרופלואיד PDMS

1. הניחו את מכשיר המיקרופלואיד PDMS שרווי קודם לכן בבופר התנועתיות על שלב המיקרוסקופ. השתמש בסרט כדי לקבע את הצינור כדי למזער הפרעה לזרימה במהלך תנועת הבמה.
2. העבר את שלב המיקרוסקופ לערוץ התצפית קרוב ליציאה. באמצעות מיקרוסקופיית שדה בהיר או ניגודיות פאזה, התמקדו במרכז ערוץ התצפית וכווננו את ההגדלה כדי להמחיש תאים חיידקיים בודדים.
3. החלף את הגדרות מסלול האור למיקרוסקופ פלואורסצנציה ומתאים את זמן החשיפה למצלמה כדי להבחין תאי חיידק בודדים (למשל, 100 מילישניות), או כך שאותות הפלואורסצנציה של התאים יהיו לפחות פי 3 חזקים יותר מרעש רקע.
4. לאחר מכן, הכנס את צינור הכניסה לצינור בקוטר 2 מ"ל המכיל את המתלה החיידקית. הפוך את כיוון המשאבה והתחל למשוך את המתלה בקצב זרימה של 1 מיקרוליטר מינה-1.
5. סרקו את החתך של כל ערוץ התצפית, והקליטו תמונה מורכבת כל 2 דקות, לאורך כל משך הניסוי.

Results

איור 1: מכשירים פלואידיים לחקר הובלה מיקרוביאלית במדיה נקבובית (A) איור של מכשיר נוזלי שעובד מפוליאטרון (מתיל מתקרילט (PMMA). המטריצה הנקבובית מושבצת לשכבת הבסיס של המכשיר, והמכסה נסגר באמצעות ברגים. חתך רוחב מראה את סידור העמודים בתוך המכש...

Materials