טרנספקציה של מערכת ביטוי גנים מושרה לתאים המבטאים חלבון אפקטור חיידקי

תקציר

מקור: ברנס, ס. ואחרים. יישום מערכת ביטוי אינדוקטיבי לחקר התערבות של גורמי אלימות חיידקיים עם איתות תוך-תאי. J. Vis. Exp. (2015)

הסרטון הזה מדגים את השימוש במערכת ביטוי אינדוקסיבית לזיהוי היכן חלבון האפקטור החיידקי CaeB משבש את מפל האפופטוטיה של המארח. הוא מפרט את השלבים להעברת תאים מבטאים CaeB למערכת מגיבה לטטרציקלין כדי לעורר ביטוי גנים פרו-אפופטוטי, במטרה לזהות את נקודת ההפרעה בתוך המפל.

פרוטוקול

1. טרנספקציה של קו התאים היציב באמצעות מערכת וקטורי הביטוי השראה

1. כליה עוברית אנושית (HEK)293 תאי זרע המבטאים באופן יציב חלבון פלואורסצנטי ירוק (GFP) או GFP-CaeB בצלחת בת 12 בארות בצפיפות של 1 x 10⁵ תאים לבאר.
2. 19 שעות לאחר הזריעה, תבצע טרנספקט משותף של התאים עם הפלסמיד הרגולטור ופלסמיד התגובה, בין אם בקידוד Bax או קספס מופעל 3.
   1. קו-טרנספקט של תאי HEK293 יציבים עם 100 ng של פלסמיד רגולטור pWHE125-P (איור 1) ו-100 ng של פלסמידי תגובה pWHE655-hBax או pWHE655-revCasp3 (איור 2) ו-0.4 מיקרוליטר פוליאתילנימין.
   2. הכינו את חומצה דאוקסיריבונוקלאית (DNA) ואת ריאגנט הטרנספקציה של פוליאתילנימין כל אחד ב-75 מיקרוליטר של מדיום Opti-MEM ודגרו בדיוק 5 דקות בטמפרטורת החדר (RT). ליצירת קומפלקס, יש לדגור את שתי התערובות יחד למשך 15 דקות ב-RT.
3. הוסיפו את תמיסת הפוליאתילנימין/DNA לכיוון הנפילה לתאים ודגרו בטמפרטורה של 37°C ב-5%_CO2.

2. השראה לאפופטוזיס

1. 5 שעות לאחר הטרנספקציה, עוררו ביטוי של החלבונים הפרו-אפופטוטיים על ידי הוספת 1 מיקרוגרם/מ"ל דוקסיציקלין למדיום התרבית. דגרו תאים במשך 18 שעות בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס ב-5%_CO2.

תוצאות

איור 1. סקירה סכמטית של הפלסמיד הרגולטורי pWHE125. אלמנטים חיוניים להתרבות בחיידקים, כולל מקור שכפול (ori pBR) וקלטת עמידות לאנטיביוטיקה נגד אמפיצילין (Amp^R), ולביטוי רגולטורי טט-טרנס-רגולטורים, כגון הפרומפטור/מגבר המוקדם הח...

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה

שם	חברה	מספר קטלוג	הערות
DMEM	טכנולוגיות חיים	31966-021
FCS	ביוכרום	S0115
עט/סטרפטוקוק	טכנולוגיות חיים	15140-122
OptiMEM	טכנולוגיות חיים	51985
X-tremeGENE 9	רוש	6365752001
פוליאתילנימין	פוליסיינס	23966
דוקסיציקלין	סיגמא אולדריץ'	D9891