ניטור רציף של רעש ביולוגי בחיידקים באמצעות מיקרוסקופ טיים-לאפס

תקציר

מקור: חיימוביץ', א. א. ואחרים. מדידה רציפה של רעש ביולוגי באשריכיה קולי באמצעות מיקרוסקופ טיים-לאפס. J. Vis. Exp. (2021)

הסרטון הזה מדגים ויזואליזציה בזמן אמת של רעש ביולוגי באי-קולי על ידי מעקב אחר תנודות בפלואורסצנציה של GFP במהלך גדילה וחלוקה של חיידקים באמצעות מיקרוסקופ טיים-לאפס.

פרוטוקול

1. הכנת הדגימה להדמיית מיקרוסקופיה
   1. הוציאו את הבקבוק מהאמבטיה. נגב את החלק החיצוני של הבקבוקון ונח לו להתקרר לטמפרטורת החדר (25 מעלות צלזיוס).
      הערה: הסר את הבקבוקון כשלוש דקות לפני שהטיימר נגמר.
   2. שפוך 3 מ"ל מהג'ל באופן קבוע להיקף הצלחת בתנועה מעגלית. תשאיר להתקשות לכמה דקות.
   3. אוטם לוחות עם סרט דבק וחורר כמה חורים עם מחט 25 G. הפוך את כל הכלים כדי למנוע עיבוי מים מטפטף על הג'ל.
   4. דגרו את כל הכלים בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס למשך 30 דקות כדי לאפשר התמצקות מלאה תוך מניעת מיטוזה של תאים.
      הערה: השאירו דגימות בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס למדידות עוקבות, לא יותר מיום אחד.
   5. הפעל את המיקרוסקופ לפי הוראות היצרן.
   6. מצא את המיקוד הראשוני באמצעות עדשת ההגברה הנמוכה ביותר והפעיל את מערכת המיקוד האוטומטית (AFS).
   7. השתמשו בשמן במידת הצורך, טבעו את העדשה בשמן ומרחו אותה בזהירות על ידי הזזת הפלטה עם בקר פלטפורמה (לא ידנית), וכך ניתן להפעיל שוב את ה-AFS.
   8. השתמש בחתך יחסי בכיוון Z, בהתאם להצעה ברירת המחדל לחתכי Z צעד.
      הערה: צלם תמונות שדה בהיר כל 5 דקות ותמונות פלואורסצנטיות כל 20 דקות. לפעמים צריך לכוון את המיקוד במהלך 30 הדקות הראשונות. חימום מוקדם של תיבת הדגמה של המיקרוסקופ והשמן, תוך קירור הדגימה, נוטה לסייע בהפחתת אובדן המיקוד הראשוני.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה

שם	חברה	מספר קטלוג	הערות
צלחת זכוכית 35 מ"מ	מטק	P35G-0.170-14-C	עובי התואם לעדשת מיקרוסקופ.
אגרוז	לונזה	5004	הכנה לליין-בלאר
אקליפס טי	ניקון		מיקרוסקופ הפוך
Immersol 518F	צייס	4449600000000	שמן טבילה
סרט פאראפילם	בימיס	PM-996	מתייחסים אליו כקלטת בטקסט