זיהוי ביטוי אנזימי מטרה בתאים חיידקיים מהונדסים גנטית

Abstract

מקור: קים, ה. ואח', סקר רב-אנזימטי באמצעות מערכת סקר אנזימים גנטית בעלת תפוקה גבוהה. J. Vis. Exp. (2016)

סרטון זה מדגים שיטת סינון גנטית לזיהוי ביטוי אנזימים באמצעות ספריות פוסמידים מטאגנומיות וסובסטרטים כרוגניים. ציטומטריית זרימה מזהה ומבודדת תאים בודדים המייצרים תוצרים צבעוניים, ומאפשרת בחירה בתפוקה גבוהה של תאים פעילים המבטאים אנזימים.

Protocol

1. הכנת ספריית המטאגנומית עם מערכת סקר אנזימים גנטית לזיהוי p-nitrophenol (pNP) (pNP-GESS)
   1. לבנות ספריית מטגנומית ב-Escherichia coli עם וקטור פוסמיד באמצעות ערכת ייצור ספריית פוסמידים.
   2. Aliquot 100 מיקרולטר של הספרייה לאחסון בטמפרטורה של −70 מעלות צלזיוס, שהיא מקור לתאי ספרייה מטגנומיים.
      הערה: צפיפות האופט של דגימה הנמדדת באורך גל של 600 ננומטר (OD₆₀₀) של מלאי ספרייה זו היא כ-100.
   3. הפשרה של 100 מיקרוליטר מספריית המטאגנומיקה המקורית על קרח והחסנת בבקבוק של 500 מ"ל המכיל 50 מ"ל לוריה-ברטאני (LB) ו-12.5 מיקרוגרם/מ"ל כלוראמפניקול, ואחריו דגירה בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס למשך שעתיים.
   4. קצור את התאים בצינור קונוסי של 50 מ"ל בצנטריפוגה בעוצמה של 1,000 x גרם למשך 20 דקות בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס.
   5. החזירו את הכדור במהירות למים מזוקקים קרים של 50 מ"ל (DW) ובצנטריפוגה ב-1,000 x גרם למשך 20 דקות בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס שוב.
   6. החזירו את הכדור ל-50 מיקרוליטר DW קר עם 10% גליצרול (v/v). השתמש ב-50 מיקרול של אליקוט תא זה לאלקטרופורציה.
   7. הניחו את תערובת התאים האלקטרוכשנטיים 50 מיקרוליטר ו-DNA pGESS(E135K) (100ng) בתוך קובטה אלקטרופורציה קרה וקרח ואלקטרופוראט (1.8 kV/cm, 25 μF) את התערובת.
   8. הוסף במהירות 1 מ"ל מרק סופר אופטימלי עם מדיום הדיכוי הקטבוליטי (SOC) ותשהה את התאים בעדינות.
   9. העבר את התאים לצינור עגול במשקל 14 מ"ל עם פיפטה ודגר בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס למשך שעה.
   10. פזר 500 מיקרוליטר מהתאים שנמצאו על פלטה מרובע בגודל LB בגודל 20 x 20 ס"מ המכילה 12.5 מיקרוגרם/מ"ל כלוראמפניקול ו-50 מיקרוגרם/מ"ל אמפיצילין. דגרו את הצלחת בטמפרטורה של 30 מעלות צלזיוס למשך 12 שעות.
   11. גרדו את המושבות באמצעות מגרד תאים ואספו תאים לצינור חרוטי של 50 מ"ל באמצעות מדיה לאחסון תאים קר מאוד.
   12. צנטריפוגה בעוצמה של 1,000 x גרם למשך 20 דקות בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס. החזירו את הכדור למדיית אחסון תאי קרח של 10 מ"ל כדי להגיע_{ל-OD 600} של 100.
   13. אליקו 20 מיקרוליטר של התאים לאחסון בטמפרטורה של −70 מעלות צלזיוס.
        
2. הסרת חיוביים שגויים מהספרייה המטאגנומית
   1. הפשיר את תאי הספרייה המטאגנומית המקוריים (משלב 1.13) המכילים DNA מטגנומי ו-pGESS(E135K) על הקרח.
   2. החריקו 10 מיקרוליטר מהתאים ב-2 מ"ל ליברל המכיל 50 מיקרוגרם/מ"ל אמפיצילין ו-12.5 מיקרוגרם/מ"ל כלורמפניקול בצינור עגול של 14 מ"ל. דגרו ב-37 מעלות צלזיוס עם ניעור ב-200 סל"ד למשך 4 שעות.
   3. בינתיים, הפעל את מכונת מיון התאים (FACS) המופעל על ידי פלואורסצנציה ופתח את תוכנת ברירת המחדל של FACS. השתמש בהגדרות הבאות: קוטר קצה הפיה, 70 מיקרון; רגישות לאזור פיזור קדמי (FSC-A), הגברה לוגריתמית 300 V; רגישות לאזור פיזור צד (SSC-A), הגברה לוגריתמית 350 V; רגישות לאזור איזותיוציאנאט פלואורסציאני (FITC-A), 450 הגברה לוגריתמית V; פרמטר סף, ערך FSC-A 5.
      הערה: הגדרות טיפוסיות ניתנות למכשיר FACS המוזכר בטבלת החומרים. כוון את ההגדרות למכשירי FACS אחרים.
   4. דילל את תאי הספרייה המטאגנומית משלב 2.2 על ידי הוספת 5 מיקרוליטר מהדגימה לצינור תחתית עגול של 5 מ"ל המכיל 1 מ"ל מלח עם בופר פוספט (PBS).
   5. הנח את דגימת הספרייה המדוללת ביציאת הטעינה של כלי ה-FACS ולחץ על כפתור טעינה בלוח הבקרה של תוכנת FACS.
   6. כוון את קצב האירוע ל-1,000 - 1,500 אירועים לשנייה על ידי לחיצה ושליטה על כפתורי קצב הזרימה בלוח המחוונים.
   7. צור תרשים פיזור FSC-A בקנה מידה של log-log לעומת SSC-A בקנה מידה של log בגיליון עבודה גלובלי על ידי לחיצה על כפתור Dot Plot בסרגל הכלים. כוון את שער הפיזור R1 כדי לכלול את אירועי הסינגלט (אוכלוסיית החיידקים) באמצעות כפתור שער הפוליגון בסרגל הכלים.
   8. שרטט היסטוגרמה עם מספר תאים לעומת FITC-A בקנה מידה לוגיתמי בגיליון העבודה על ידי לחיצה על כפתור ההיסטוגרמה. לאחר מכן, כוון את מתח ה-FITC מהלשונית הגדרות ציטומטר בחלון Inspector Control כך ששיא ההתפלגות בצורת פעמון יהיה פחות מ-10² של FITC-A.
   9. צור FSC-A בקנה מידה לוגריתמי לעומת גרף הלוג FITC-A על ידי לחיצה על כפתור Dot Plot בגיליון העבודה הגלובלי. קבע שער מיון R2 בגרף באמצעות כפתור שער הפוליגון בסרגל הכלים כך שהשער ממוקם בין +5% ל--5% תאים ממרכז ההתפלגות (סה"כ 10% תאים סביב שיא העקומה בצורת פעמון).
   10. הניחו צינור איסוף המכיל 1.2 מ"ל LB המכיל 50 מיקרוגרם/מ"ל אמפיצילין ו-12.5 מיקרוגרם/מ"ל כלורמפניקול ביציאה של מכשיר ה-FACS וממיין 10⁶ תאים המקיימים את שערי R1 ו-R2.
   11. הסר את צינור האיסוף, הפקק והמערבולת בעדינות.
        
3. סקר אנזימים מטגנומי
   1. דגרו את התאים הממוינים (משלב 2.11) בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס עם ניעור ב-200 סל"ד עד שה-OD₆₀₀ מגיע ל-0.5.
   2. הוסף 1 מיקרוליטר תמיסת השראת עותק כדי להגביר את מספר עותק הפוסמיד התוך-תאי. דגרו את התאים למשך 3 שעות נוספות בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס עם ניעור ב-250 סל"ד.
   3. כדי להכין תאים למיון, הוסף 0.5 מ"ל מהתאים המתרבתים ומצע מתאים (p-nitrophenyl אצטט, p-nitrophenyl-β-D-cellobioside, או פניל פוספט) לצינור עגול-תחתית של 14 מ"ל בריכוז סופי של 100 מיקרומון.
      1. לדגימת ביקורת, הוסף 0.5 מ"ל מהתאים המתורבתים משלב 3.2 לצינור עגול במשקל 14 מ"ל. הוסף את אותו נפח PBS כמו נפח המצע בשלב 3.3.
   4. דגרו את שתי הדגימות בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס עם ניעור ב-200 סל"ד למשך 3 שעות.
   5. בינתיים, הכן את מכונת ה-FACS עם אותן תצורות כמו שלב 2.3.
   6. הוסף 5 מיקרוליטר של התאים (למיון) ותאי בקרה לשני צינורות 5 מ"ל עם תחתית עגולה המכילות 1 מ"ל PBS, בהתאמה.
   7. הנח את הצינור המכיל תאי הבקרה על פתח הטעינה של ה-FACS ולחץ על כפתור טעינה בלוח הבקרה של תוכנת ה-FACS. כוון את קצב האירוע ל-1,000 - 3,000 אירועים לשנייה על ידי שליטה בכפתורי קצב זרימה בלוח המחוונים.
   8. צור תרשים פיזור של FSC-A בקנה מידה לlog-log לעומת SSC-A בקנה מידה לוגיתמי על ידי לחיצה על כפתור Dot Plot בגיליון העבודה הגלובלי של התוכנה, וכיוון את שער הפיזור R1 כך שיכלול את אירועי הסינגלט (אוכלוסיית החיידקים) באמצעות כפתור Polygon Gate בסרגל הכלים.
   9. צור גרף פיזור FSC-A בקנה מידה log-log לעומת FITC-A בקנה מידה log-scale על ידי לחיצה על כפתור Dot Plot בגיליון העבודה, והגדר שער מיון R2 על הגרף באמצעות כפתור Polygon Gate בסרגל הכלים כך שפחות מ-0.1% מהתאים השליליים יזוהו בתוך שער R2.
   10. החלף את צינור הדגימה הבקרה בצינור דגימת המיון, והתאים את קצב האירועים ל-1,000 - 3,000 אירועים לשנייה על ידי שליטה בכפתורי קצב הזרימה בלוח המחוונים.
   11. הניחו צינור איסוף המכיל 0.5 מ"ל LB ביציאת מכשיר ה-FACS ומיין 10^{תאים 4} המקיימים את שערי R1 ו-R2.
       הערה: קריטריון המיון יכול לנוע בין 0.1% ל-5% העליונים של FITC-A בשער R2. בפרוטוקול זה, 1% התאים העליונים נאספו כחיוביים.

Materials