הסרטון הזה מדגים שיטה למידול תסיסה מיקרוביאלית במעי על ידי דגירה של דגימות צואה עם סיבים תסיסים בתנאי אנאירוביה לחקר ייצור מטבוליטים על ידי מיקרוביום המעיים.
הרשמה ל-JoVE נדרשת לצפייה בתוכן זה. התחברו או התחילו בגרסת ניסיון בחינם.
מאמר שיטה
In-Vitro מודל גידול אצווה לחיקוי תסיסה של המעי הגס על ידי מיקרוביום המעי האנושי
786 צפיות
⸱
28 בנובמבר 2025
במאמר זה
תקציר
פרוטוקול
כל ההליכים הכוללים איסוף דגימות בוצעו בהתאם להנחיות ה-IRB של המכון.
זהירות: עיינו בגיליונות הנתונים המתאימים לבטיחות חומרים ופעל לפי ההוראות וההנחיות להכשרה מתאימה ברמת בטיחות ביולוגית רמה 2 (BSL-2). עקבו אחרי כל שלבי הגידול בהתאם לכללי הבטיחות הביולוגית הסטנדרטיים והשתמשו בארון BSL-2 בתנאים אספטיים. יתרה מזאת, דגימות צואה ממודלים שונים ונבדקים אנושיים עלולות להיות בסיכון פוטנציאלי להפצת מחלות המועברות על ידי מיקרוביאליות. פנה מיד לעזרה רפואית במקרה של פציעה או זיהום. בנוסף, יש לאשר שימוש בדגימות צואה של אדם ובעלי חיים באמצעות ועדות אתיות מוסדיות ולעמוד בפרוטוקולים לשימוש בדגימות ובמידע הנבדק.
1. הכנת מדיה תרבותית
- הכנת מדיה תרבותית, הכנת תשעה סוגי פתרונות מלאי:
- תמיסה A (1,000 מ"ל): המיס 5.4 גרם נתרן כלוריד (NaCl), 2.7 גרם פספט דיהידרוגן אשלגן (KH2PO4), 0.16 גרם סידן כלוריד דיהידרט (CaCl2.2H 2O), 0.12 גרם מגנזיום כלוריד הקסיהידרט (MgCl2.6H 2O), 0.06 גרם טטרהידרט כלוריד מנגן (MnCl2.4H 2O), 0.06 גרם של הקסהידרט כלוריד קובלטוס (CoCl 2.6H 2O), ו-5.4 גרם סולפט אמוניום (NH4)2SO4, במים דה-יוניים כדי להגיע לנפח כולל של 1,000 מ"ל.
- תמיסה B (1,000 מ"ל): המיס 2.7 גרם פוספט אשלגן מימן (K2HPO4) במים דה-יוניים כדי להגיע לנפח כולל של 1000 מ"ל.
- תמיסת מינרלים זעירים (1,000 מ"ל): המיסה של 500 מ"ג די-נתרן אתילנדיאמין-טטראצטט דיהידרט (Na2EDTA), 200 מ"ג סולפט ברזל הפטהידרט (FeSO4.7H 2O), 10 מ"ג אבץ סולפט הפטהידרט (ZnSO4.7H 2O), 3 מ"ג כלוריד טטרהידרט מנגן(II) (MnCl2.4H 2O), 30 מ"ג חומצה זרחנית (H3PO4), 20 מ"ג CoCl2.6H 2O, 1 מ"ג דיהידראט כלוריד קופריק (CuCl2.2H 2O), 2 מ"ג ניקל(II) כלוריד הקסיהידרט (NiCl2.6H 2O) ו-3 מ"ג נתרן מוליבדט דיהידרט (Na2MoO4.2H 2O) במים דה-יוניים כדי להגיע לנפח כולל של 1,000 מ"ל.
הערה: תמיסה זו רגישה לאור, לכן הקפידו לאחסן אותה בצינורות/בקבוקים כהים/שחורים או עטופים באלומיניום. - תמיסת ויטמינים מסיסת במים (1,000 מ"ל): המיס 100 מ"ג תיאמין הידרוכלוריד (Thiamin-HCl), 100 מ"ג חומצה D-פנטותנית, 100 מ"ג ניאצין, 100 מ"ג פירידוקסין, 5 מ"ג חומצה P-אמינובנזואית, ו-0.25 מ"ג ויטמין B12 במים דה-יוניים כדי להגיע לנפח כולל של 1,000 מ"ל.
- חומצה פולית: תמיסת ביוטין (1,000 מ"ל): המיס 10 מ"ג חומצה פולית, 2 מ"ג D-ביוטין ו-100 מ"ג אמוניום ביקרבונט (NH4HCO3) במים דה-יוניים כדי להגיע לנפח כולל של 1,000 מ"ל.
- תמיסת ריבופלבין (1,000 מ"ל): ממסים 10 מ"ג ריבופלבין בתמיסת HEPES (4-(2-הידרוקסיאתיל)פיפראזין-1-אתנסולפוניק חומצה) (1.19 גרם לליטר) כדי להגיע לנפח כולל של 1,000 מ"ל.
- תמיסת המין (10 מ"ל): המיסה של 5,000 מ"ג המין בתמיסת 10 מ"מ נתרן הידרוקסיד (NaOH) (0.4 גרם/ליטר) כדי להגיע לנפח כולל ל-10 מ"ל.
- תערובת חומצות שומן קצרות שרשרת (10 מ"ל): שילוב של 2.5 מ"ל N-ולרט, 2.5 מ"ל איזווולרט, 2.5 מ"ל איזובוטיראט, ו-2.5 מ"ל: DL-α-מתילבוטיראט.
הערה: הפתרון הזה מומלץ להשתמש במכסה אדים כדי למנוע ריח ואדים. - רזזורין (1,000 מ"ל): ממיס 1 גרם רזורין במים דה-יוניים ומביא את הנפח הכולל ל-1,000 מ"ל.
- מדיום המשמש לתסיסה אנאירובית במבחנה
- להכנת חומר זה, יש לערבב 330 מ"ל תמיסה A, 330 מ"ל תמיסה B, 10 מ"ל תמיסת מינרלים זעירים, 20 מ"ל תמיסת ויטמינים מסיסה במים, 5 מ"ל פוליטן: תמיסת ביוטין, 5 מ"ל תמיסת ריבופלבין; 2.5 מ"ל תמיסת המין, 0.4 מ"ל תערובת חומצות שומן קצרות שרשרת, 1 מ"ל רזאורין, 0.5 גרם תמצית שמרים, 4 גרם פחמת נתרן (Na2CO3), 0.5 גרם ציסטאין HCl-H2O, ו-0.5 גרם טריפטיקאז, והוסף 296.1 מ"ל מים מזוקקים.
- בדוק את ה-pH וודא שהוא סביב 7.0; אם לא, כוון את ה-pH עם 1 N HCl או 1 N NaOH. סטריליזציה על ידי סינון ואקום של המדיה באמצעות פילטר בקבוק מתחת לעמדת העבודה האספטית.
- חלופה נוספת היא לערבב את כל הרכיבים (חוץ מתמיסות ויטמינים והמין) ולהשתמש באוטוקלב ב-121 מעלות צלזיוס למשך 20 דקות ולתת לזה להתקרר לטמפרטורת החדר. במקביל, סננו את תמיסות הוויטמינים והמין באמצעות מסנני ממברנה בקוטר 0.22 מיקרון והוסיפו אותם למדיה המאוטוקלבת והמקוררת לפני ההזנה.
2. הכנת תא אנאירובי וחומרים נדרשים
- שמרו את כל החומרים, התמיסות והכלים הנדרשים לניסוי התסיסה בתוך התא האנאירובי לפחות 48 שעות לפני תחילת הניסוי, כדי להבטיח שכל חמצן שנותר הקשור לכלים ולחמצן מסיס בבופרים/תמיסות יוסר וכל החומרים מותאמים לתנאים האנאירוביים שנקבעו.
הערה: החומרים הנדרשים בתוך התא האנאירובי (48 שעות לפני תחילת הניסוי): (i) מדיום התסיסה; (ii) תמיסה אנאירובית (מוכנה לפי סעיף 4.1), (iii) וורטקסר, (iv) מאזן שקילה, (v) בדי גבינת מוסלין, (vi) מספריים, (vii) משפך, (viii) צינורות 1.5, 2.0, 15, 50 מ"ל, (ix) פיפטור (2, 20, 200 ו-1,000 מיקרוליטר) וקצות פיפט תואמים, (x) פיפט ותיקים (5 ו-10 מ"ל), (xi) טישו נייר, (xii) טושים, (xiii) מייצגים שפופרות שונות, (xiv) קופסת פסולת, (xv) מד O2 ו-(xvi) בקבוק תרסיס אתנול 70% (חומר חיטוי).
3. הכנת צינורות וסיבים
- שקלו 300 מ"ג אינולין והעבירו לצינור בנפח 50 מ"ל, ואחריהם תוספת אספטית של 26 מ"ל מדיום תסיסה שכבר הוכן ואוחסן בתא האנאירובי. הכינו שפופרת ריקה אחת לכל סוג דגימת צואה ולצינור(ים) ניסיוניות (בהתאם למספר התרכובות הנבדקות), בשלוש עותקים.
- השאירו את הצינורות בתוך התא האנאירובי לכ-24 שעות כדי לאפשר הידרציה של דגימות לפני תחילת ניסוי התסיסה. ודא שטמפרטורת הצינור היא 37 מעלות צלזיוס בעת החיסון, ולכן הביא את הצינורות באינקובטור בתוך תא אנאירובי.
4. הכנת החיסון
- תמיסת דילול אנאירובית (לפחות 48 שעות לפני ניסוי התסיסה): המיס 5 גרם NaCl, 2 גרם גלוקוז ו-0.3 גרם ציסטאין-HCl במים דה-יוניים והגעת הנפח הכולל ל-1,000 מ"ל. אוטוקלב ואחסן אותו בתוך התא האנאירובי לפחות 48 שעות לפני השימוש.
- הכנת חיסון צואה (ביום ניסוי התסיסה): שקלו 5 גרם דגימת צואה טרייה בצינור קוני של 50 מ"ל, הוסיפו תמיסת דילול אנאירובית לנפח סופי של 50 מ"ל (1:10 w/v) ומערבולת למשך 15 דקות או עד שהתהליך הומוגני לחלוטין. סיננו את התערובת ההומוגנית דרך 4 שכבות של בד גבינה סטרילי (אוטוקלב) והשתמשו בה מיד לחיסון בצינורות המכילות מדיום.
הערה: ניתן לאגד את דגימות הצואה מקבוצה של נבדקים אם מטרת הניסוי היא להשוות את השפעת תרכובת/רכיב מסוים על המיקרוביום הבריא לעומת המיקרוביוטי של הצואה החולה באופן כללי.
5. תסיסה ודגימה
- הכינו צינורות לפי סעיף 4.2 וחינו שפופרות ריקות/בקרה וניסוייניות ב-4 מ"ל של חיסון צואה מדולל ומסונן. דגרו את הצינורות המחוסנים בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס בתוך תא האנאירובי. נער את הצינורות פעם בשעה על ידי הפיכה עדינה כדי להחזיר את הסיבים והחינוי.
- אסוף דגימות בתדירות הנדרשת, לדוגמה, כל שעה עד 0, 3, 6, 9 ו-24 שעות במהלך התסיסה על ידי הוצאת דגימת אליקוט של 2 מ"ל לצינור של 2 מ"ל מצינורות התסיסה המתאימים.
- למדוד את ה-pH של האליקוטים באמצעות מד pH מעבדה (על ידי הכנסת אלקטרודת ה-pH ישירות לדגימה); צנטריפוגה את הדגימה הנותרת ב-14,000 x גרם למשך 10 דקות בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס. הקפיאו מיד את הסופרנטנט והכדור בחנקן נוזלי, ולאחר הקפאה חדה, מאחסנים את הסופרנטנט לניתוח SCFAs (חומצות שומן קצרות שרשרת) וכדור לניתוח מיקרוביום בטמפרטורה של -80 מעלות צלזיוס.
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
חומרים
| שם | חברה | מספר קטלוג | הערות |
|---|---|---|---|
| ביקרבונט אמוניום | סיגמא-אלדריץ' | 217255 | |
| סולפט אמוניום | TGI | C2388 | רעיל |
| סידן כלוריד די-הידראט | סיגמא-אלדריץ' | C3306 | מעצבן |
| כלוריד קובאלטוס הקשהידרט | סיגמא-אלדריץ' | 255599 | |
| דיהידראט כלוריד קופרי | אקרוס אורגני | 2063450000 | רעיל, מעצבן |
| ציסטאין-HCl | סיגמא-אלדריץ' | C121800 | |
| D-ביוטין | סיגמא-אלדריץ' | B4501 | |
| חומצה פנטותנית D- | אלפא אסאר | A16609 | |
| די-סודיום אתילנדיאמינטטטראצטט דיהידראט | ביוראד | 1610729 | |
| DL-α-מתילבוטריאט | סיגמא-אלדריץ' | W271918 | |
| סולפט ברזל הפטהידראט | סיגמא-אלדריץ' | F8263 | רעיל |
| חומצה פולית | אלפא אסאר | J62937 | |
| גלוקוז | סיגמא-אלדריץ' | G8270 | |
| המין | סיגמא-אלדריץ' | H9039 | |
| הפס | אלפא אסאר | A14777 | |
| איזובוטיראט | אלפא אסאר | L04038 | |
| איזוולרט | אלפא אסאר | A18642 | |
| מגנזיום כלוריד הקסיהידרט | סיגמא-אלדריץ' | M8266 | |
| טטרהידרט כלוריד מנגן | סיגמא-אלדריץ' | 221279 | |
| ניאצין (חומצה ניקוטינית) | סיגמא-אלדריץ' | N4126 | |
| הקסיהידרט כלוריד ניקל(II) | אלפא אסאר | A14366 | רעיל |
| N-ולרט | סיגמא-אלדריץ' | 240370 | |
| חומצה P-אמינובנזואיק | חבר פרלמנט סין | 102569 | רעיל, מעצבן |
| חומצה זרחנית | סיגמא-אלדריץ' | P5811 | |
| אשלגן דיהידרוגן פוספט | סיגמא-אלדריץ' | P5504 | |
| פספט מימן אשלגן | סיגמא-אלדריץ' | 1551128 | |
| פירידוקסין | אלפא אסאר | A12041 | |
| רזורין | סיגמא-אלדריץ' | R7017 | |
| ריבופלבין | אלפא אסאר | A11764 | |
| פחמת נתרן | סיגמא-אלדריץ' | 1613757 | |
| כלוריד נתרן | פישר ביוריאגנטים | 7647-14-5 | |
| נתרן הידרוקסיד | פישר כימיקלים | S320 | |
| נתרן מוליבדאט דיהידראט | אקרוס אורגני | 206375000 | |
| תיאמין הידרוכלוריד | אקרוס אורגני | 148991000 | |
| טריפטיקאז | BD ביוסיינסס | 211921 | |
| ויטמין B12 | סיגמא-אלדריץ' | V2876 | |
| תמצית שמרים | סיגמא-אלדריץ' | 70161 | |
| אבץ סולפט הפטהידרט | סיגמא-אלדריץ' | Z0251 | |
| מסנן ממברנה 0.22 מיקרון | |||
| חרוזי טיהור מגנטי של AMPure | אג'נקור | ||
| תא אנאירובי עם אינקובטור | פורמה אנאירובית, Thermo Scientific, ארה"ב | ||
| פילטר בקבוק | קורנינג | ||
| בד גבינה | |||
| מד pH | |||
| מערבולת | תרמו-מדעי |
תגיות
