תסיסה מיקרואירובית של הידרוליזאט במבוק על ידי Klebsiella pneumoniae

תקציר

מקור: Wei, D., ואחרים, ייצור כימיקלים על ידי Klebsiella pneumoniae באמצעות הידרוליזאט במבוק כחומר גלם. J. Vis. Exp. (2017)

הסרטון הזה מדגים את ההמרה המיקרוביאלית של סוכרים שמקורם בבמבוק ל-2,3-בוטנדיול על ידי גידול Klebsiella pneumoniae במדיום מבוסס הידרוליזאט בתנאים מיקרואירוביים וחומציות קלות.

פרוטוקול

1. ייצור בוטנדיול 2,3 על ידי Wildtype K. pneumoniae

1. השתמשו ב-3 ליטר הידרוליזאט במבוק כממס להכנה בינונית.
2. הכינו מדיום תסיסה המכיל 4 גרם לליטר ליקר תירס, 2 גרם לליטר (NH₄)₂SO₄, 6 גרם לליטר K₂HPO₄, 3 גרם לליטר KH₂PO₄, ו-0.2 גרם לליטר MgSO₄. כוון את ה-pH של המדיום לנייטרלי באמצעות 2.5 M NaOH. השתמש בביוריאקטור בנפח 5 ליטר המכיל 3 ליטר של מדיום תסיסה מאוטוקלב לתסיסה.
3. השתמש בתאי K. pneumoniae המאוחסנים במקרר בטמפרטורה נמוכה של -80°C.
4. לגידול הזרעים, דגרו בקבוק בנפח 250 מ"ל המכיל 50 מ"ל מדיום לוריה-ברטאני (LB) למשך הלילה בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס, עם ניעור ב-200 סל"ד. השתמש במדיום LB המכיל 10 גרם לליטר טריפטון, 5 גרם לליטר תמצית שמרים, ו-10 גרם לליטר NaCl. הערה: צפיפות התאים של תרבית הזרעים צריכה להגיע ל-OD 2 (צפיפות אופטית ב-600 ננומטר).
5. החסן בקבוקון אחד של 50 מ"ל של תרבית הזרעים בביוריאקטור. שמרו על התרבית ב-pH של 6.0 ו-37 מעלות צלזיוס. השתמשו בקצב תוספת אוויר של 2 ליטר לדקה ובקצב ערבוב של 250 סל"ד, מה שיוצר מצב מיקרואירובי.
6. אספו דגימות של 5 מ"ל כל שעתיים במהלך התסיסה ונתחו אותן עם כרומטוגרפיה נוזלית בלחץ גבוה כדי לקבוע את ריכוזי הכימיקלים בציר.
7. עקוב אונליין אחרי האלקלי שנוסף לביוריאקטור באמצעות מערכת תאי דלק מיקרוביאליים/איסוף נתונים (MFCS/DA).
   הערה: חומצות אורגניות מיוצרות בתהליך התסיסה, ומוסיפים NaOH כדי לשמור על יציבות pH של התרבית. נפח האלקלי שנוסף מייצג את כמות החומצה המיוצרת. כאשר הקו שנוסף על ידי אלקלי מתיישר, התהליך מסתיים, בין אם בגלל מיצוי מקור הפחמן או מוות תאים.

2. ייצור R-אצטואין על ידי מוטנט budC של K. pneumoniae

1. הכינו מדיום לייצור אצטואין המכיל 4 גרם לליטר ליקר תירס, 2 גרם לליטר (NH₄)₂SO₄, 3 גרם לליל נתרן אצטט, 0.4 גרם לליטר KCl ו-0.1 גרם לליטר MgSO₄.
2. השתמש ב-K. pneumoniae-ΔbudC לייצור R-אצטואין. חזור על שלבים 1.4-1.5.
   הערה: budC מקודד 2,3-בוטנדיול דה-הידרוגנאז. K. pneumoniae-ΔbudC מאבד את פעילות 2,3-בוטנדיול דה-הידרוגנאז ומייצר R-אצטואין במקום 2,3-בוטנדיול.
3. שמרו על התרבית ב-pH של 6.0 ו-37 מעלות צלזיוס. השתמשו בקצב תוספת אוויר של 4 ליטר לדקה ובקצב ערבוב של 450 סל"ד, מצב אירובי.
   הערה: תוספי החמצן גבוהים יותר מזה של ייצור 2,3-בוטנדיול.
4. בדוק את הדגימות כפי שבשלב 1.6.

3. 2-ייצור חומצה קטוגלוקונית על ידי הניצן מוטנט של K. pneumoniae

1. לייצור חומצה קטוגלוקונית 2, יש להשתמש באותו מדיום כמו לייצור R-אצטואין.
2. השתמש ב-K. pneumoniae-ΔbudA לייצור חומצה 2-קטוגלוקונית. חזור על שלבים 1.4-1.5.
   הערה: budA מקודד α-אצטולקטט דקרבוקסילז. K. pneumoniae-ΔbudA מאבד את פעילות הדקרבוקסילאז α-אצטולקט ומייצר חומצה קטוגלוקונית 2-קטוגלוקונית, תוך שימוש בגלוקוז כמצע.
   הערה: סינתזת חומצה 2-קטוגלוקונית היא תהליך התלוי בתנאים חומציים. פותחה תסיסה דו-שלבית לייצור חומצה קטוגלוקונית דו-קטוגלוקנית; בשלב הראשון, תרבית הזרעים מחוננת לתוך הביוריאקטור.
3. שמרו על התרבית ב-pH של 7.0 ו-37 מעלות צלזיוס. השתמשו בקצב תוספת אוויר של 4 ליטר לדקה ובקצב ערבוב של 500 סל"ד.
   הערה: בתנאים אלו, התאים גדלים במהירות רבה (צפיפות התאים מגיעה ל-OD 7 בכ-4 שעות). לאחר מכן, התסיסה מתקדמת לשלב השני, שבו pH התרבית יורד ל-5.0. לא מוסיפים חומצה; החומצות האורגניות המיוצרות בתרבות גורמות באופן טבעי לירידה ב-pH. בתנאים חומציים אלו, גדילת התאים נעצרת, אך חומצה 2-קטוגלוקונית מסונתזת ומצטברת בציר.
4. בדוק את הדגימות כפי שבשלב 1.6. שימוש בהידרוליזאט של במבוק כמקור פחמן.
   הערה: הגלוקוז במדיום מומר לחומצה 2-קטוגלוקונית, והקסילוז מומר לחומצה קסילונית. כך מתקבלת תערובת של חומצה קטוגלוקונית 2 וחומצה קסילונית.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה

שם	חברה	מספר קטלוג	הערות
אוטוקלאב	סניו	3780
ביוריאקטור	Sartorius stedim biotech	בוסטאט אפלוס
אגיטייטור	איקה	RW 20
מערכת כרומטוגרף נוזלי בעלת ביצועים גבוהים	חברת שימאדזו	20AVP
אבקת במבוק	נרכש ממחוז ג'ג'יאנג, סין		מספר רשת, 50
צלולאז	Youtell Biochemical, שאנדונג, סין		200 PFU/מ"ל