גישה מבוססת כרומטוגרפיה נוזלית–ספקטרומטריית מסה לניתוח מטבוליטים מ-S. aureus

תקציר

מקור: סמואלס, ד. ג'יי. ואחרים. גישה מבוססת כרומטוגרפיה נוזלית טנדם–ספקטרומטריית מסה לניתוח מטבוליטים של סטפילוקוקוס אוראוס. J. Vis. Exp. (2017)

סרטון זה מדגים את השימוש בכרומטוגרפיה נוזלית–ספקטרומטריית מסה לזיהוי וכמת מטבוליטים תוך-תאיים מ-S. aureus. הוא מפרט את השלבים המעורבים בהפקת מטבוליטים, נרמול פפטידים, כרומטוגרפיה נוזלית וניתוח ספקטרומטרי מסה.

פרוטוקול

1. חילוץ מטבוליטים

1. הפשרה של דגימות על קרח רטוב והפרעה לתאים בהומוגניזר עם ארבעה פיצוצים של 30 שניות במהירות 6,000 סל"ד, עם שתי דקות קירור על קרח יבש בין מחזורים.
2. בהירו את הליזטים למשך 15 דקות במיקרוצנטריפוגה מקוררת במהירות מקסימלית (כלומר, 18,213 x גרם ב-≤4 מעלות צלזיוס).
3. העבר את הסופרנטנט לצינור מיקרוצנטריפוגה נקי.
4. באמצעות מיקרופיפטה, העבר חלק קטן מהדגימה לצינור מיקרוצנטריפוגה לצורך כימות תכולת הפפטידים השארית בשלב 2; אחסן את השאר בטמפרטורה של מינוס 80°C.
   הערה: נפח הדגימה השמורה משתנה, בהתאם לבדיקה של חומצה ביצינכונינית (BCA) ששימשה בשלב 2.1. דגימה זו צריכה להישמר על קרח רטוב לניתוח מיידי או להקפאה בטמפרטורה של מינוס 80°C.

2. בדיקת חומצה ביצינכונינית (BCA)

1. בצע בדיקת BCA כפי שהומלץ על ידי יצרן הערכה, תוך שימוש בדגימות משלב 1.4 כדי לקבוע את ריכוז הפפטיד השארי לכל דגימה.

3. כרומטוגרפיה נוזלית-ספקטרומטריית מסה (LC-MS)

1. מערבבים 75 מיקרוליטר של תמצית סטפילוקוקוס אוראוס (S. aureus) עם 75 מיקרוליטר של ממס LC-MS B, שהוכן בשלב 1.4.
2. Vortex מערבב ומסתובב ב-13,000 x g למשך 5 דקות.
3. הניחו 100 מיקרוליטר של סופרנטנט בתוך בקבוקון כרומטוגרפיה נוזלית (LC) וסגרו אותו. ודא שאין בועות אוויר כלואות בדגימה.
4. טען את מבחנות ה-LC על ה-LC-MS autosampler וערוך את הרשימה הרצה בתוכנה "Offline Worklist Editor".
   1. מלאו את עמודות "שם הדגימה" (למשל, wild-type-1), "מיקום דגימה" (למשל, P1-A1), "שיטה" (למשל, שיטת חומצה פורמית-שלילית), ו"קובץ נתונים" (למשל, wild-type-1). לחץ על כפתור "שמור רשימת עבודה". פתח את תוכנת "Mass Spectrometry Data Acquisition Workstation" והזן את רשימת העבודה שנשמרה קודם. לחץ על כפתור "Start Worklist Run" כדי להתחיל את מדידת LC-MS הרציפה.
5. הפרדו את הדגימות בעמודה, קשרו את העמודה לספקטרומטר זמן טיסה (TOF), ומחברים את ספקטרומטר ה-TOF למערכת LC. השתמשו בגרדיאנט פאזה ניידת כך: 0-2 דקות, 85% ממס B; 3-5 דקות, 80% ממס B; 6-7 דקות, 75% ממס B; 8-9 דקות, 70% ממס B; 10-11.1 דקות, 50% ממס B; 11.1-14 דקות, 20% ממס B; ו-14.1-24 דקות, 5% ממס B; לסיים בתקופת איזון מחדש של 10 דקות בממס B של 85% וקצב זרימה של 0.4 מ"ל ^min-1.
6. באמצעות משאבה איזוקרטית, יש להחדיר תמיסת מסה ייחוס לתוך המסלול כדי לאפשר כיול ציר מסה סימולטני.
   הערה: שלב זה מבוסס על מדריך ספקטרומטר TOF הסטנדרטי.
   1. השתמשו בתערובת של חומצה אצטית D4 וקסאקיס (1H,1H,3H-טטראפלואורופרופוקסי) פוספאזין כתמיסת מסה ייחוס לביצוע הכיול בזמן אמת. השתמשו במשאבה איזוקרטית עם קצב זרימה של 2.5 מ"ל ^{מינימום 1} להזרמה.

4. תיקון אצווה של ספירות יונים

1. הקצה כל דגימה שתשמש כמדגם ייחוס לתיקון אצווה (למשל, סוג פראי, שכפול 1).
2. חשב את סכום ספירת היונים עבור כל המטבוליטים במדגם הייחוס. חזור על החישוב הזה עבור כל הדגימות.
3. חלק את סך היונים של כל דגימה במספר היונים הכולל של מדגם הייחוס כדי ליצור יחס.
4. חלק את ספירת היונים של כל מטבוליט בדגימה ביחס הדגימה/ייחוס כדי לקבל ספירת יונים מתוקנת אצווה לכל מטבולייט.

5. נרמול פפטידים

1. חלק את ערכי ספירת היונים המתוקנים באצווה עבור כל דגימה שהתקבלה בשלב 4 בריכוז הפפטידים שנקבע במבחן BCA בשלב 2 כדי לקבל ערך מנורמל לכל מטבולייט.
   הערה: ניתן להשוות ישירות בין הזנים ולעבור ניתוח סטטיסטי (למשל , מבחן U של מאן-וויטני). לחילופין, מטבוליט הידוע כבלתי משתנה בעקבות הטיפול או הרקע הגנטי עשוי לשמש כמנרמל לזיהוי שינויים הנובעים מפירוק מטבוליטים. הכללת כמות ידועה של L-נורוואלין או חומצה גלוטארית בבופר החילוץ יכולה לשמש לתיקון אובדן במהלך עיבוד הדגימה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה

שם	חברה	מספר קטלוג	הערות
חומרים/ציוד
צינורות עמידים בפני פגיעה, 2 מ"ל	USA Scientific	1420-9600
חרוזי סיליקה, 0.1 מ"מ	Biospec Products Inc	11079101Z
הומוגניזר פרסליס 24	ברטין אינסטרומנטס	EQ03119-200-RD000.0
ערכת בדיקת חלבון מיקרו-BCA	פירס (תרמו-סיינטיפיק)	23235
עמודת הידריד יהלום קוגנט מסוג C	אג'ילנט	70000-15P-2
זמן טיסה מדויק (TOF) LC-MS, סדרת 6200	אג'ילנט	G6230B
Quat Pump, סדרת 1290	אג'ילנט	G4204A
משאבת פח, סדרת 1290	אג'ילנט	G4220A
Valve Drive, סדרת 1290	אג'ילנט	G1107A
משאבת איזוקרטית, סדרת 1290	אג'ילנט	G1310B
TCC, סדרת 1290	אג'ילנט	G1316C
סמפלר, סדרת 1290	אג'ילנט	G4226A
תרמוסטט, סדרת 1290	אג'ילנט	G1330B
כימי
מלח עם מאגר פוספט (pH 7.4) 10x	אמביון	AM9624	מדלל טרי ל-1x עם מים אולטרה-טהורים
אצטוניטריל	פישר סיינטיפיק	A955-500	אופטימה LC-MS
חומצה פורמית	סיגמא אולדריץ'	94318	בספקטרומטריית מסה, 98%
MassHunter	אג'ילנט	G3337AA
זן חיידקי	מינים	זן	גנוטיפ
SRB 337	סטפילוקוקוס אוראוס	USA200 MSSA UAMS-1	סוג פראי
SRB 372	סטפילוקוקוס אוראוס	USA200 MSSA UAMS-1	ΔcodY::erm