ניטור צמיחת חיידקים בנוסחאות מדיה נפרדת באמצעות מיקרוביוריאקטור אוטומטי

תקציר

מקור: המריך, ג'. ואחרים. פרוטוקול לאופטימיזציה של ייצור חלבונים הטרולוגיים באמצעות טכנולוגיית מיקרוביוריאקטור אוטומטית. J. Vis. Exp. (2017).

הסרטון הזה מדגים את השימוש במיקרוביוריאקטור אוטומטי לניטור צמיחת חיידקים והפרשת חלבון פלואורסצנטי בתגובה לפורמולות מדיה משתנות. חיידק מהונדס גנטית המבטא חלבון פלואורסצנטי מהפריש מתרבתים תחת ברירה אנטיביוטית ומחוסן לבארות מגוונות מבחינת תזונה. מדידות אופטיות בזמן אמת של צפיפות תאים ופלואורסצנציה מאפשרות ניתוח השוואתי של ייצור חלבונים בתנאי גדילה שונים.

פרוטוקול

1. הכנת חומרים ונהלי הגדרה
הערה: מומלץ להגדיר ולתקן את שיטות הניסוי ברמה מפורטת. סטנדרטיזציה זו מבטיחה שניתן לעקוב אחרי תוצאות שונות לשונות ביולוגית פנימית או להרכבים שונים של מדיום. ​
הערה: פתרונות מניות מדיה: הכינו פתרונות מניות אישיים לכל רכיבי המדיה שנחקרו. הכינו מלאי מרוכז מאוד כדי לאפשר דילול נפחים שונים לכל הרכיבים. משמעות הדבר היא שלאחר שילוב כל תמיסות המלאי בנפח הגבוה ביותר בהתאם לתכנית התכנון, זה לא יכול לעלות על נפח הגידול הסופי, ראה סעיף "יצירת רשימת פיפטינג תמיסת מלאי בינוני" שלב 1.3.3. אם הוספת תמיסה מרוכזת מאוד גורמת לנפח תוספת נמוך מאוד, למשל < 1/100 מנפח הגידול הסופי, יש לדלל את תמיסת המלאי בהתאם. לדוגמה, במחקר זה, נפח פיפטציה של פחות מ-10 מיקרוליטר הוגדר כבלתי ישים. בדרך כלל, תמיסות יסודות זעיר מרוכזות עד פי 1,000 ביחס לריכוז הסטנדרטי הסופי בתווך. יתרון לרכז רכיבי מדיה כמכפלות (X-fold) ביחס לריכוזים במתכון ההתייחסות. כך נמנעים נפחי פיפטינג בלתי אפשריים של עשרוני חלקי. מתכונים מפורטים לכל תמיסות המלאי של מדיום CgXII מופיעים במסמך המשלים.

1. בנק תאים פעיל (WCB)
הערה: לכל ניסוי גידול משתמשים באליקווט אחד של WCB. אם נדרשים יותר אליקווטים, השתמש במדיום של 100 מ"ל עירוי לב מוחי (BHI) בבקבוקי שייק של 1,000 מ"ל או החסן בקבוקי שייק מרובים, שמצטברים לפני הוספת תמיסת גליצרול.

1. הכינו מושבות בודדות של זן הביטוי הרקומביננטי C. glutamicum pCGPhoDBs-GFP43 על לוחות אגר (37 גרם לליטר אבקת BHI, 20 גרם לליטר אגר, 25 מ"ג לליטר קאנמיצין). חומר הציפוי יכול להגיע מטרנספורמציה טרייה או מאליקווט שמור בקריופר. דגירה בטמפרטורה של 30 מעלות צלזיוס עד להופעת מושבות בודדות; בדרך כלל זה לוקח יום עד יומיים.
2. החסן תרבית בקבוק שייקר (50 מ"ל מדיום BHI עם 25 מ"ג/ל"ר קאנמיצין, 500 מ"ל בקבוק מבודד, 250 סל"ד, קוטר ניעור 25 מ"מ, 30 מעלות צלזיוס) עם חומר מושבה ודגירה למשך הלילה (כ-16 שעות).
3. משלבים נפח אחד של תליית התא המתקבלת עם נפח אחד של תמיסת גליצרול סטרילית בנפח 500 גרם לליטר ומפזרים ב-2 מ"ל אליקוטים בבקבוקי שימור סטריליים. אחסן בטמפרטורה של -80°C.

2. פרוטוקול גידול MBR
הערה: במערכת BioLector MBR במחקר זה, אור מפוזר (ביומסה) ופלואורסצנציה GFP הן מדידות עוצמה, שדורשות הקצאת ערך רווח מסוים. ככל שהרווח גבוה יותר, כך האות האופטי מוגבר יותר; זו גם הסיבה שאור מפוזר ופלואורסצנציה נמדדים ביחידות שרירותיות (A.U.). קביעת ערכי רווח מתאימים לזיהוי ביומסה ו-GFP בניסויים ראשוניים, יחד עם תדירות רעידה ונפח מילוי מתאימים כדי להימנע מהגבלת חמצן בריכוזי ביומסה גבוהים יותר בשלבים מאוחרים יותר של התהליך. תנאי הגידול המשמשים ("לוחות פרחים", כלומר MTPs בצורת פרח עם 48 בארות, תדירות רעידה של 1,200 סל"ד, נפח מילוי של 1,000 מיקרוליטר, 10 גרם גלוקוז כמקור הפחמן העיקרי) הבטיחו גידול ללא חמצן. לקצבי העברת חמצן מקסימליים הנובעים משילובים אחרים של נפחי מילוי ותדרי רעידה ב-MTPs בצורת פרחים עם 48 בארים, זמינים גיליונות נתונים מהספק. כמו כן, פגמי גדילה בתרביות בודדות עלולים להתרחש עקב כמויות נמוכות של תת-קרקע משניים (למשל, חנקן, יסודות זעירים). לכן, בדוק את ריכוזי הביומסה בסיום הגידול. במחקר זה לא נצפו השפעות צמיחה כאלה.

1. הגדר את פרוטוקול הגידול למערכת MBR ("BioLector") כך:
2. מסננים 1: ביומסה, רווח 14. סט פילטרים 2: pH, הגיין מוגדר מראש. סט פילטרים 3: pO2, הגיין מוגדר מראש (preset). 4: GFP, עלייה של 80.
3. תדר רעידות: 1,200 סל"ד.
4. טמפרטורה: 30 מעלות צלזיוס.
5. זמן המחזור: 15 דקות.
6. זמן הניסוי: ידני (הטיפוח לא יופסק אוטומטית).

3. יצירת רשימת פיפטינג בתמיסת חומר בינוני
הערה: כמעט כל מערכת רובוטית לטיפול בנוזלים מסוגלת לקרוא פעולות פיפטינג מקבצים חיצוניים. בעיקרון, המידע המינימלי הנדרש הוא נפח ההעברה ומיקום משאב המגבה, וכן היעד של כל אחד מהם המיוצג על ידי מיקום מעבדה על הדק הרובוטי וחלל ספציפי בתוך המעבדה. עם זאת, יש לקחת בחשבון תחביר שונה למערכות טיפול בנוזלים שונים. איור 1 מציג דוגמה למבנה קובץ עבור מערכת הפיפט בשימוש במחקר זה.

1. ארבעה סוגי תמיסות מלאי מוזרמים לכל באר גידול:

1. פתרונות מלאי לרכיבי מדיה מגוונים ("מניות וריאציה").
2. מים כדי לפצות על הנפחים המצטברים השונים של המלאי הנ"ל.
3. תמיסת מקור ("Rest Stock") המכילה את כל הרכיבים הקבועים. תמיסת המלאי הזו יכולה להיות מורכבת ממלאי המכיל רכיבים שונים, למשל, שנשמרים בטמפרטורות שונות או עוברים סטריליציה בשיטות שונות.
4. אינוקולום, שיש להוסיף כרכיב האחרון ולהניח על שולחן העבודה ממש לפני ההוספה כדי למנוע שקיעת התאים.

2. לכל באר גידול, יש לחשב את הנפחים שיש להעביר עבור כל רכיבי המדיה בהתאם:

הנפח שיש להוסיף עבור מניות שונות מסוימות עשוי להיות אפס, כלומר כאשר הרכיב הספציפי הזה מושמט.

3. לעדכן את כל נפחי ה-Vi המחושבים למספרים מתאימים. עלייה בנפח הפיפטינג בשלבי הנפח לא צריכה להיות קטנה מדי. אם צריך, התאימו את ריכוזי מלאי הווריאציה. לדוגמה, נפח הפיפטינג המינימלי כאן הוגדר כ-10 מיקרוליטר, והתוספת המינימלית הוגדרה כ-5 מיקרוליטר. באופן כללי, נפחים אלו צריכים להיות מוגדרים בהתבסס על דיוק וניסוי שנקבעו בניסוי עבור תחנת טיפול בנוזלים בשימוש.

4. חשב את נפח מלאי המנוחה המכיל את הרכיבים הקבועים לכל הבארות כך:

כאשר משתמשים בנפח המצטבר המקסימלי של מלאי הווריאציה. לכן, יש לחשב את הריכוזים הנדרשים של הרכיבים הקבועים במלאי המנוחה כך:

הכינו את המלאי הנותר בהתאם.

5. לכל באר עיבוד, חשב את נפח המים שיש להוסיף כך:

6. לכל באר גידול, רשום את כל הנפחים שיש להוסיף לפי סדר החיבור הבא: V_H2O, V_RestStock, V_i, V_Inok. עצב את רשימת הפיפט לפי מפרט תחנת הטיפול בנוזלים, כפי שמוצג למשל באיור 1.

2. תרבות זרעים, הכנה אוטומטית למדיה ותחילת התרבות הראשית

1. צור פרוטוקול לרובוט הטיפול בנוזלים. ראו איור 2 ואיור 3 לדוגמה פרוטוקול למערכת "Janus", שמיושם בתוכנת "WinPREP" המתאימה. הפרוטוקול צריך לקחת בחשבון את ההיבטים הבאים:

1. לכלול זמן מספיק של מגורים סטריליים לפני הכנת התקשורת.

2. לכלול ניקוי ושטיפה מופרזים של כל קצות הפיפטינג והצינורות.

3. בחר מיכלי כלי מעבדה מתאימים לפתרונות מלאי. כאן, לוחות באר עמוקים עם 12 עמודים מתאימים לאחסון מלאי וריאציה, שכן כל שמונה קצות הפיפטינג יכולים לשקוע בסידור מקביל לעמודי הבאר. זה מזרז מאוד את ההכנה לתקשורת. אם משתמשים בצינורות תגובה של 15 מ"ל או 50 מ"ל כמאגרים, רק קצה פיפטינג אחד יכול להיכנס אליו בו זמנית. למלאי אחרים כמו מים ומלאי מנוחה, משתמשים בתעלות של 100 מ"ל, שכן פתרונות אלו דורשים נפחים גדולים יותר בסך הכל.

4. לספק נפח כולל מספק לכל תמיסת מלאי כדי לפצות על נפחי בזבוז, הזזות גובה של פיפטינג וכו'.

5. הכנס הנחיות משתמש לפני שלב החיסון, כדי לוודא שהשלב מתבצע מיד לפני תהליך תרבית הזרעים.

2. הכינו את כל תמיסות המלאי בצורה סטרילית ואחסנו אותן עד השימוש, במכלים מתאימים, לדוגמה, מבחנות סטריליות בנפח 15 מ"ל ו-50 מ"ל.
3. לחטא את לוחות הבאר העמוקים לאחסון תמיסת המלאי על שולחן עבודה, למשל על ידי ניקוי עם 70% אתנול וייבוש לאחר מכן במכסה זרימה למינרי.
4. התחילו את תרבית הזרעים על ידי חיסון 50 מ"ל מדיום BHI המכיל 25 מ"ג/ליטר קאנמיצין עם אליקווט אחד מה-WCB. לפני גידול ה-MBR, יש להכין חיסון טרי וחיוני מתרביות זרעים שגדלות בקצב מעריכי בכמות מספקת.
5. הנח את כל כלי המעבדה הנדרשים על שולחן העבודה הרובוטי ושפך תמיסות מלאי לכלי המעבדה המתאימים.
6. התחל את זרימת העבודה הרובוטית להכנת המדיה, כך שהשלב האחרון (החיסון) יושג בזמן עם תחילת גידול הזרעים. יש להעריך מראש את סך זמן הריצה של זרימת העבודה הרובוטית. כאן, משך הריצה הכולל היה כ-1.5 שעות.
7. דגום את תרבית הזרעים לאחר כ-2 שעים, ואז כל שעה, כדי לעקוב אחר הצמיחה לפי צפיפות אופטית (OD₆₀₀). לאחר כ-5 שעות, התרבית מגיעה ל-3-4 OD₆₀₀ ומשמשת לחיסון התרביות העיקריות.
8. הנח את תרבית הזרעים על שולחן העבודה של מטפל הנוזלים והמשך בפרוטוקול הכנת המדיה. גידול כלבי ים MTP לאחר החיסון.
9. הניחו את MTP הגידול האטום במכשיר BioLector והתחילו את פרוטוקול הגידול המוגדר מראש.
10. להשליך את תמיסות המלאי שנותרו, בהתאם לתקנות הבטיחות הביולוגית במידת הצורך, ולזרוע את התרבית משולחן העבודה הרובוטי. נקה את כלי המעבדה הניתנים לשימוש חוזר והתחל את פרוטוקול ניקוי הטיפול בנוזלים.

תוצאות

איור 1: צילום מסך מרשימת הפיפטינג בנפח לניתוח רגישות. רשומות בעמודה הראשונה מקצות מזהה ייחודי לכל נפחי השורה; מזהה זה הוא מספר הבאר של MTP של MTP המטרה בגידול הנוזלים, ראה איור 3C. העמודות הנותרות מקודדות נפחים לפתרו...

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה

שם	חברה	מספר קטלוג	הערות
ביולקטור	M2P-Labs	G-BL-100
פלורפלייט	M2P-Labs	MTP-48-BOH	לגידול במכשיר BioLector
נייר כסף איטום	M2P-Labs	F-GP-10	איטום סטרילי ל-Flowerplate
MATLAB	מת'וורקס	2016ב
KriKit	Forschungszentrum Jülich	לא זמין	זמין בחינם, נדרש התקנת MATLAB
רובוט פיפטינג יאנוס	פרקין אלמר	לא זמין	כולל התקנת תוכנת "WinPrep"
מיקרופלטת באר בעומק 12 עמודות	E&K Scientific	EK-2034	מיכל לפתרונות מלאי בינוני
C. glutamicum pCGPhoDBs-GFP	לא זמין	לא זמין	נושא פלסמיד pEKEx2 עם מיזוג של גן GFP ופפטיד אות PhoD מ-B.subtilis כהזנת ביטוי. פלסמיד מספק עמידות לקאנאמיצין. תואר ופורסם על ידי מייסנר ואח'. Appl Microbiol Biotechnol 76 (3), 633–42 (2007)