הקפאה ארוכת טווח של זנים ציאנובקטיים באמצעות גליצרול או דימתיל סולפוקסיד

תקציר

מקור: ליה-סמית', ד. ג'. ואחרים. יצירת מוטנטים מסומנים וללא סימנים במינים ציאנובקטריאליים מודליים. J. Vis. Exp. (2016)

הסרטון הזה מדגים את שימור ההקפאה של זנים ציאנובקטריאליים על ידי שילוב תסמיני תאים מרוכזים עם גליצרול או DMSO ואחסונם בטמפרטורות נמוכות, מה שמאפשר תחזוקה ארוכת טווח של תרביות ברות קיימא לפוטוסינתזה ומחקרים גנטיים.

פרוטוקול

1. הכנת מדיה תרבותית

1. הכינו את BG11 מדיום
   1. הכינו תמיסות מלאי של 100x BG11, יסודות קורט וקת ברזל (טבלה 1).
   2. הכינו תמיסות נפרדות של מאגר פוספט, נתרן פחמתי (Na_{2CO 3}), בופר N-[Tris(hydroxymethyl)methyl] -2-aminoethanesulfonic acid (TES), וביקרבונט נתרן (NaHCO₃) (טבלה 1).
   3. אוטוקלאב את מלאי הפוספט ו-Na₂CO₃ . סינון סטריליזציה של בופר TES ו-NaHCO₃ עם פילטרים של 0.2 מיקרון.
   4. הכינו את BG11 על ידי שילוב של 976 מ"ל מים, 10 מ"ל של 100 מ"ל BG11, 1 מ"ל של יסודות זעירים, ו-1 מ"ל של ברזל, ואוטוקלאב את התמיסה. לאחר שהתמיסה התקררה לטמפרטורת החדר, הוסיפו 1 מ"ל של ציר פוספט, 1 מ"ל מציר Na₂CO₃ , ו-10 מ"ל NaHCO₃.
   5. למדיום מוצק BG11, הוסיפו 15 גרם אגר ו-700 מ"ל מים לבקבוק אחד. לבקבוק השני, יש להוסיף 3 גרם נתרן תיוסולפט (Na₂S₂O₃), 226 מ"ל מים, 10 מ"ל של 100x BG11, 1 מ"ל של יסודות זעירים, ו-1 מ"ל של ציר ברזל. אוטוקלאב את שתי הפתרונות האלה. לאחר שהתמיסות הללו התקררו לטמפרטורת החדר, ערבבו אותן והוסיפו 1 מ"ל של ציר פוספט, 1 מ"ל מצר Na_2CO3, 10 מ"ל של בופר TES ו-10 מ"ל NaHCO₃.
      הערה: התמיסות מוכנות בנפרד כדי למנוע השקעה של מלחים מסוימים.
2. לברירה על סוכרוז, הכינו תמיסת סוכרוז של 50% (בלי וי). סינון את התמיסה עם מסנני 0.2 מיקרון והוסף ל-BG11 (100 מ"ל סוכרוז 50% עד 900 מ"ל BG11) ליצירת לוחות סוכרוז BG11/5%.
   הערה: אל תוסיפו NaHCO₃ לצלחות אגר סוכרוז BG11/5%. תוסיף_{Na 2}CO₃ כרגיל.
3. לגידול סינצ'וקוקוס, יש להוסיף 10 מ"ל של 1 מ' 4-(2-הידרוקסיאתיל)פיפרזין-1-אתאנסולפונית, N-(2-הידרוקסיאתיל)פיפרזין-N′-(2-אתןסולפונית) (HEPES) ו-1 מ"ל ויטמין B12 (טבלה 1) ל-1 ליטר של מדיום BG11.
   הערה: טרנספורמציה של זנים שגודלו במדיה מסחרית של BG11 היא פחות יעילה משמעותית מאשר במתכוני המדיה של BG11 המתוארים כאן ולכן אינה מומלצה.

2. אחסון ארוך טווח של זנים

1. הקמים תרבית חדשה של הזן על ידי חיסון לולאה מלאה בתאים לתוך 30-50 מ"ל של מדיום BG11. גדלו את התרבית למשך 3-4 ימים עד ל-OD_{750 ננומטר} = 0.4 עד 0.7.
2. שטפו תאים פעם אחת עם BG11 ומשאירו מחדש ~2 מ"ל של BG11.
3. הוסף 0.8 מ"ל של תאים מרוכזים לצינור אחד. לאחר מכן מוסיפים 0.2 מ"ל של 80% גליצרול מחוטא במסנן.
4. אופציונלי: להוסיף 0.93 מ"ל של תאים מרוכזים לצינור אחר. הוסף 0.07 מ"ל DMSO לצינור הזה.
   זהירות: DMSO הוא רעיל וצריך לטפל בו בהגנה מתאימה.
5. אחסן את שני הצינורות בטמפרטורה של -80 מעלות צלזיוס. כדי להחיות זנים, הסר את הצינור וגרד כמה תאים עם קיסם קהה על פלטת אגר ללא אנטיביוטיקה. תצא כרגיל עם לולאה סטרילית.

טבלה 1: הפתרונות ששימשו במחקר זה

מתכוני תמיסות בצי
כימי	כמות (g)
100x BG11 (לליטר)
NaNO3	149.6
MgSO4.7H 2O	7.49
CaCl2.2H 2O	3.6
חומצה ציטרית	0.6
הוסף 1.12 מ"ל 0.25 מ' Na2EDTA, pH 8.0
0.25 M Na2EDTA, pH 8.0 (ל-100 מ"ל)
נא2EDTA	9.3
אלמנטים זעירים (ל-100 מ"ל)
H3BO3	0.286
MnCl2.4H 2O	0.181
ZnSO4.7H 2O	0.022
Na2MoO 4.2H 2O	0.039
CuSO4.5H 2O	0.008
Co(NO3)2.6H 2O	0.005
קת ברזל (ל-100 מ"ל)
אמוניום ברזלי ציטראט	1.11
מלאי פוספט (ל-100 מ"ל)
K2HPO4	3.05
מלאי Na2CO3 (ל-100 מ"ל)
Na2CO3	2
buffer TES, pH 8.2 (ל-100 מ"ל)
TES	22.9
מלאי NaHCO3 (ל-100 מ"ל)
NaHCO3	8.4
HEPES, pH 8.2 (ל-500 מ"ל)
HEPES	119.15
ויטמין B12 (ל-50 מ"ל)
ציאנוקובלאמין	0.02
Luria Bertani media (Per 500 מ"ל)
מרק לוריה ברטאני	12.5
1 מיליון MgCl2 (ל-100 מ"ל)
MgCl2.6H 2O	20.33
תמיסה A (ל-200 מ"ל)
MnCl2.4H 2O	0.395
CaCl2.2H 2O	1.47
2-(N-מורפולינו)אתאנסולפוניק חומצה הידראט, 4-מורפולינית-סולפונית (MES)	0.4265
תמיסה A + גליצרול
10 מ"ל תמיסה A
1.5 מ"ל גליצרול

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה

שם	חברה	מספר קטלוג	הערות
NaNO₃	סיגמא	S5506
MgSO₄·7H₂O	סיגמא	230391
CaCl₂	סיגמא	C1016
חומצה ציטרית	סיגמא	C0759
Na₂EDTA	פישר	EDT002
H₃BO₃	סיגמא	339067
MnCl₷4H₂O	סיגמא	M3634
ZnSO₄·7H₂O	סיגמא	Z4750
Na₂MoO₄·2H₂O	סיגמא	331058
CuSO₄·5H₂O	סיגמא	209198
Co(NO₃)₂·6H₂O	סיגמא	239267
אמוניום ברזלי ציטראט	סיגמא	F5879
K₂HPO	סיגמא	P3786
Na₂CO₃	פישר	SODC001
TES	סיגמא	T1375
NaHCO₃	פישר	SODH001
HEPES	סיגמא	H3375
ציאנוקובלאמין	סיגמא	47869
Na₂S₂O₃	סיגמא	72049
בקטו אגר	BD	214010
סוקרוזה	פישר	SUC001
צלחת פטרי 90 מ"מ עם אוורור משולש	גריינר	633185
מסנני 0.2 מיקרון	סארטוריוס	16534
בקבוקי חרוט בגודל 100 מ"ל	פיירקס	CON004
Parafilm M 100 מ"מ x 38 מ'	בימיס	FIL003
פולימראז DNA באיכות גבוהה של Phusion	פיוזיון	F-530
אגרוז	מלפורד	MB1200
ערכת טיהור DNA	מוביו	12100-300
אנדונוקלאזים להגבלה	NEB
ליגאז T4	תרמו-סיינטיפיק	EL0011
מרק לוריה ברטאני	Invitrogen	12795-027
MES	סיגמא	M8250
סולפט קאנמיצין	סיגמא	60615
אמפיצילין	סיגמא	A9518
ערכת מיני-פרפ פלסמיד של GeneJET	תרמו-סיינטיפיק	K0503
צינור 14 מ"ל עם תחתית עגולה	BD פלקון	352059
GoTaq G2 Flexi DNA פולימראז	פרומגה	M7805
חרוזי זכוכית 425-600 מיקרון	סיגמא	G8772
גליצרול	סיגמא	G5516
DMSO	סיגמא	D8418
נורות פלואורסצנטיות	גרו-לוקס	69
פוטוביוריאקטור HT מולטטרון	אינפורס