$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
ת: צנתור עורקי כירורגי של Circulation ו ורידי
חלק 1: עורקים צנתר ורידי הכנה
- חותכים 15 ס"מ של PE-50 (קוטר פנימי של 0.58 מ"מ (0.023 ") x קוטר חיצוני של 0.965 מ"מ (0.038"). Cut קטע 1mm של צינורות silastic (0.76mm (0.030 ") בקוטר פנימי x 1.65mm (0.065 ") קוטר חיצוני) לשימוש הרחקה חרוז. הרחקה חרוז מונע מן החולדה מוציאה את הקטטר פעם זה נמצא במקום.
- הכנס את קצות מלקחיים לנתח מיקרו לתוך לומן של חרוז הרחקה בעדינות להחזיק את קצות המלקחיים מלבד למתוח את פתיחת הרחב. בעזרת עוד זוג מלקחיים לנתח מיקרו, להחליק את צינורות silastic לתוך לומן של חרוז הרחקה. מאובטח עם דבק דבק חזק (סופר Loctite דבק). חרוז חייב לשכב סביב הקטטר. אפשר קטטר להתייבש (24 שעות).
- עבור עכברוש 300 גרם, הקו הוא עורק ~ 2.7cm מן חרוז הרחקה ואילו קו הצוואר הוא ~ 3.2cm. אורכי צנתר מתוך ריסון מותאמים על ידי 0.5cm כל 100 גרם לעלייה במשקל הגוף. אל שפוע הקצוות של הקטטר כמו זו עלולה לנקב את כלי השיט במהלך הכניסה.
- בסמוך לפני הניתוח, למלא את השורות עם מלוחים heparinized (10U/ml), חותם את שני הקצוות עם תוסף צינורות נירוסטה מקום אתנול (70%) לעקר. האוויר יבש לפני הכניסה.
חלק 2: הכנת כירורגי
- נהלים אושרו על ידי האוניברסיטה של טיפול בבעלי חיים קלגרי השתמש הוועדה לציית theCanadian האגודה למדעי המעבדה מנחים בעלי חיים לניסויים. הנהלים המפורטים להלן בוצעו על, גבר מבוגר Sprague-Dawley חולדות (~ 300 גרם). כל ההליכים מתבצעים תחת isoflurane, אם כי ניתן להשתמש בזריקות הרדמה. כל הנהלים כירורגית מבוצעים הבטחת טכניקות aseptic. ציוד כירורגי, כוסות מלוחים heparinized הם מעוקרים החיטוי. כפפות מנתחים, מזרקים applicators כותנה היטה נרכשים מעוקרים מהספק.
- לשקול את העכברוש ולהקליט את התוצאה. משקל יהיה חשוב ניטור לאחר ניתוח של חיות. חיות רק כדי להחזיר את משקל טרום ניתוח רמות אמור לשמש לניסויים. להרדים חולדה (3% isoflurane) בתיבת הרדמה. שמור את העכברוש ב ~ 2% isoflurane במהלך הניתוח בעזרת חרטומו. הניתוח חייב להתבצע באזור וחיטוי שמקדם asepsis.
- הכן את החיה על ידי הסרת שיער באתר כירורגית (הצוואר והשכמות). גוזז שיער קטנות או מקריח כימי ניתן להשתמש. בצע נוהל זה באזור נפרד מהמקום שבו הניתוח להתנהל.
- Secure חיים אל שולחן הניתוח. ודא החיה בהרדמה מלאה על ידי בדיקת נוכחות של כף הרגל / העין רפלקסים. הכן את האתרים כירורגית עם חומר חיטוי העור המתאים (אתנול 70% ואחריו לשפשף בבטאדין ואחריו אתנול 70%).
חלק 3: כירורגיה
- הפוך קטן חתך אנכי 1cm קו האמצע עדיפה על עצם החזה (תרימי העור longitudinally לאורך ציר המדיאלי עם מלקחיים ולחתוך עם מספריים או סכין המנתחים).
- בלאנט לנתח באמצעות מלקחיים לנתח מיקרו לחשוף את השריר sternomastoid שמאל. לשקף את השריר לחשוף 1cm בקירוב של עורק התרדמה השמאלי. שימוש במלקחיים לנתח מיקרו תחת העורק הראשי לקיים את עורק במקום. בעדינות להקניט את רקמת החיבור של עורק הצוואר. חשוב לבודד את העצב התועה מן העורק מבלי לפגוע או את העורק או העצב. לבודד את עורק אז ולקשור את הקצה cephalad עם תפר משי 4-0 (זה ישמש כדי לתפעל את העורק הראשי במהלך הניתוח). הערה: תפרים 4-0 צריך להיות מעוקר עם אתנול 70% לפני השימוש.
- קלאמפ כלי עם משוננת, מיקרו לנתח מלקחיים. לנקב את סוף ligated עם מתאם 21 VENOJECT Multi-Sample מד Luer. הסר את תקע חלד צינורות פלדה בזהירות להכניס קטטר בעזרת ההיכרויות קטטר סטרילי להודות בכך לתוך העורק. הבטחת קטטר מאובטח עם מלקחיים, מלקחיים לשחרר חלקית בניתוח מיקרו מהדק את העורק והמשך החדרת צנתר אל חרוז. בשלב זה, את קצה הקטטר יש קשת אבי העורקים. שימו לב שלא לשחרר קטטר, לחץ של כלי תאלץ אותו החוצה.
- קושרים שתי התפרים 4-0 היטב מתחת חרוז אחד מעל לאשר קטטר יהיה המדגם. פלאש קו עם מלוחים heparinized 10U/ml. חבר מחדש את הקצה החיצוני של הקטטר עם תוסף צינורות נירוסטה.
- באמצעות חתך זהה, בוטה לנתח לחשוף ימין וריד חיצוני. לבודד היטב ולקשור את הקצה cephalad עם תפר משי. את הווריד לנקב עם מתאם 21 VENOJECT Multi-Sample מד Luer. הסר את תקע חלד צינורות פלדה להכניס קטטר עם ג סטריליתatheter ההיכרויות לשני תפרים חרוז ועניבה מתחת חרוז. עניבה תפר third מעל חרוז לאשר כי דגימות. פלאש עם קו ורידי 10U/mL heparinized מלוחים. חבר מחדש את סוף קטטר חיצוני עם תקע צינורות נירוסטה.
- מנהרת 14-מחט מד בוטה מתחת לעור ולגרום חתך בגב בין השכמות. נושא צנתרים דרך המחט אל exteriorize אותם בחלק האחורי של החולדה. 4cm כ קו גלוי. גזור 0.5cm של Tubing Tygon רפואי S-50-HL, מקום אותו סביב הן צנתרים exteriorized ובטוחה עם קלטת כנדרש (וריד כחול, אדום העורק). בדוק שוב צנתרים כדי להבטיח patency, לשטוף ולמלא עם 150U/ml heparinized מלוחים כדי למנוע קרישה.
- סגור את כל החתכים עם תפר 3-0 משי. המקום עכברוש מועדים, בכלוב, טרום חימם נקי עם אוכל בתחתית הכלוב.
B: טיפול לאחר הניתוח
חלק 1: טיפול לאחר הניתוח ניטור מיידי
- לאחר העכברוש חוזר היכולת אמבולטורי ערנות מלאה להחזיר את החולדה לדיור בעלי חיים.
- אפשר החולדה להתאושש במשך 3-5 ימים.
- מעקב יומי על הכאב זיהום, ושינויים במשקל. הזיהום יכול להיות דאגה אם הפרשות מאתרים חתך, עייפות כללית ו / או כאב הוא ציין. כאב הוא הצביע על ידי יציבה כפופה, פרווה בחזרה ופרע והיעדר התנהגות אמבולטורי ו / או אכילה. אובדן המשקל יכול להיות מורגש מיד לאחר הניתוח עד שלושה ימים לאחר הניתוח, לעומת זאת, משקל צריך לייצב ו / או להגדיל עד למרחק של 10% במשקל לפני הניתוח בתוך 5 ימים. איבוד משקל חמור עשוי להצביע, השבץ זיהום ו / או כאב.
- בדוק שוב צנתרים יומי כדי להבטיח patency.
חלק 2: patency צנתר שמירה
- כל יום במהלך ההחלמה שלאחר הניתוח, למלא 1ml עצה מזרקים סליפ עם מלוחים heparinized 150U/ml ונכסה את זה עם מחט 22 מד בוטה. המחט קהה מוחדר 20 ס"מ של צינור PE-50 עם 23 מד חלד מצמד צינורות פלדה בקצה השני.
- הסר בועות אוויר על ידי הנחת סוף עם מצמד צינורות גבוה יותר מאשר שאר חלקי המזרק 1ml לדחוף את הבועות מחוץ לקו.
- הצמד את קו עורקי מוחצן מן החולדה עם hemostats ממש מתחת התקע.
- הסר את תקע קטטר פלדה באמצעות הזוג השני של hemostats.
- הכנס את מצמד צינורות המחוברים המזרק לתוך הקו העורקים לשחרור hemostats occluding את הקטטר עורקי מוחצן.
- לשאוב את הדם בעורקים של קטטר לתוך המזרק. אם קטטר לא לצייר בקלות זה עשוי להיות נחוץ כדי לדחוף בעדינות כמות קטנה של סומק פתרון באמצעות קטטר כדי לסלק את קצה הצנתר במקרה זה תקוע על הקיר כלי. קטטר כבר פינתה לחלוטין כאשר הדם מגיע מזרק.
- הצמד קרוב PE-50 צינורות אל המזרק 1ml ועושה המזרק. החלף עם מזרק חדש מלא מלוחים טריים heparinized 150U/ml. Unclamp בצינור והחזקה של מזרק חדש זקוף, קפיצי מזרק חדש עם אצבע כדי לסלק בועות אוויר אפשרי חדש מעלה מן הקו. הערה: יש להקפיד על טיפול כמו בועות אוויר יכול לגרום לשבץ.
- להזריק מלוחים heparinzed 150U/ml עד קו קטטר ברורה ללא דם.
- הצמד את קו עורקי מוחצן מן החולדה עם hemostats ממש מתחת מצמד הצינורות. הסר את מחבר מזרק מקו קטטר עורקי ולהחליפו בתקע צינורות נירוסטה.
- שחרר את hemostats occluding את הקטטר עורקי מוחצן.
- חזור על קו ורידי. עם זאת, בגלל הדגימה נמוך לחץ ורידי הוא לעתים קרובות לא אפשרי. אם מלוחים heparinzed 150U/ml יכול להיות חדור התנגדות מינימלית סביר כי היא ממוצבת היטב קטטר בווריד.
C: Hyperinsulinemic-Euglycemic קלאמפ
חלק 1: קלאמפ הקמה והכנה
- לשקול את העכברוש ולהקליט את המשקל. זה יידרש כדי לקבוע לאינסולין וגלוקוז שיעורי עירוי. Fast החולדה לפחות 5 שעות לפני הניסוי. זה מבטיח החיה נמצאת במצב הארוחה ואת התרומה של גלוקוז ממקורות תזונתיים ממוזער. מניחים את החולדה במיכל כלוב קטן / עם מצעים אשר מגביל תנועה מוגזמת. בעלי חיים צריכים להיות מסוגלים להסתובב בחופשיות החתן.
- הגדרת קווים משאבות אינפוזיה כפי שניתן לראות באיור 1. P50 צינורות באורכים החיבור הן כדלקמן: מזרק ל-Y הוא מחבר 8cm, מחבר Y כדי עכברוש הוא 15 ס"מ, קו עורקי הוא 20 ס"מ, קו ורידי הוא 10 ס"מ אורך. הסר חלד צינורות פלדה המתחבר סומק קווי עורקי הצוואר ועל מנת להבטיח עירוי ודגימה בהתאמה עם מלוחים heparinized 10U/ml.
- קבע אינסולין נפח הנדרש. זה ישתנה בהתאם לרמת אינסולין משקל החולדה. כאן, 4mU/kg/min מנוהל בקצב של 2uL/min. זהו מינון גבוה פיזיולוגיים. במידת האפשר, ניסיונות צריך להיעשות כדי להגביל כרכים עירוי. אינסולין צריך להיות מדולל כראוי להינתן בנוכחות פלזמה. פלזמה 3% חולדה פתרון מלוחים משמש לדלל את האינסולין במעבדה זו. אינסולין הוא HumulinR 100U/ml (אלי לילי); למרות משחק אחר אינסולין מהיר יכול להיות מועסק. ודא אינסולין מדולל מעורבב היטב לפני לשים מזרק עירוי.
- הכן דקסטרוז 50%. זה יכול להיות ממוקם ישירות על המשאבה עירוי לתוך המזרק. סמן משאבה עם "גלוקוז" כדי למנוע בלבול בעתיד. זכור כדי להבטיח כרכים מספקת של אינסולין וגלוקוז למחקר. Clamps בדרך כלל האחרון ~ 2h. בפרוטוקול הנוכחי, מזרקים 3ml משמשים.
- המקום גלוקוז מזרקים אינסולין על דגם Apparatus הרווארד 11 פלוס משאבות מזרק. Advance גלוקוז למחבר ה-Y קו עם מהדק hemostat. אינסולין מראש על בעלי חיים, מהדק קו עם hemostat. קלאמפ קווי ולאפשר עכברוש להירגע במשך 30 דקות לפני תחילת הניסוי. הערה: טיפ השומרים Hemostat מוצעות על מנת למנוע קבע crimping הקווים.
- הכן צנטריפוגות ו EDTA מצופה צינורות איסוף פלזמה. במחקר הנוכחי, דגימות דם נוספות יושג פעם החי הוא הידק.
חלק 2: פרוטוקול הניסוי
- אינסולין בסיסית מדגם מדגם המטוקריט צריכה להיות נרכשת. דגימה המטוקריט מבטיחה נפח הדם נשמר לאורך כל הניסוי. באופן כללי, רמות ההמטוקריט לא צריך ליפול יותר מ -10% מהערך הראשוני.
- השג מדגם גלוקוז בסיסית (One Touch Ultra, LifeScan, Inc) ולקבוע את רמת הגלוקוז בדם כל להיות מהודק. כאן, אנו מהדק את euglycemia, או 5.0-5.5mm (איור 2). לאחר כל דגימה דם, שטוף את קו עורקי עם נפח קטן של 10U/ml heparinized מלוחים כדי למנוע קרישה. הערה: ודא שאין בועות אוויר או קרישי נמצאים בקו לפני יציקת. אלה יכולים לתת את החיה שבץ.
- התחל עירוי אינסולין. קח את רמת הגלוקוז בדם ב 5-10min במרווחים, ניטור גלוקוז בכל נקודת זמן. התאם את קצב עירוי גלוקוז כנדרש עד למצב יציב מושגת. תהליך זה הוא בדרך כלל תהליך של ניסוי וטעייה יכול לקחת 30 דקות עד> 2h. רמות הגלוקוז הנדרש כדי לשמור על הגלוקוז תלויים בפרוטוקול, זנים ניסיוניים התנאים הנוכחיים (איור 2).
- יציב רמות הגלוקוז המדינה הם שלוש קריאות רצופות בטווח מוגדר. כאן, בשלוש קריאות בתוך ~ 1mm נחשב הידק (למשל 4.8, 5.2, 5.6mM). לאחר מצב יציב מושגת, להקליט את קצב עירוי גלוקוז נדרשות לשמור הגלוקוז למשך 30 דקות. במהלך תקופה זו דגימות דם נוספות ניתן להשיג. לכל הפחות, פלזמה שנייה אינסולין מדגם מדגם המטוקריט יש לקבל.
- לאחר מהדק הושלמה, בעלי חיים יכול לשמש לבדיקות נוספות או מורדמים ורקמות שנאספו לניתוח נוסף. בהתאם החיה, קווי קטטר יכול להישאר פטנט על 5-7 ימים.
D: Hyperinsulinemic-Euglycemic (אינסולין) תוצאות קלאמפ
כאשר מבוצע כהלכה, מהדק את ההליך ומעריך את מצב יציב אינסולין הרגישות של החולדה. בהציגו נתונים המתקבלים מהדק, חשוב לתעד את רמות הגלוקוז ואת שיעורי עירוי גלוקוז. רמות גלוקוז יציבה לאורך זמן של מינימום של 30 דקות (איור 3) מעידים על מצב יציב. גלוקוז נחשבת יציבה רק אם רמת הסוכר בדם כולו נשמר בתוך ~ 1mm. שיעורי עירוי גלוקוז להראות את רמות הגלוקוז אקסוגניים נדרשות לשמור הגלוקוז. במידת האפשר, נתונים אלו צריכים להיות כפי שמוצג כמובן זמן ולא ערך, אחת בממוצע (איור 4).
אמצעים אחרים מומלץ להיות דיווחו הם אינסולין פלזמה המטוקריט. הנחישות של צום וגם הידק רמות אינסולין אינסולין לאשר כי כבר מנוהל בהצלחה יזהה כל הבדלים ברמות בין קבוצות הטיפול (איור 5). אמצעים המטוקריט קבלת בתחילת המחקר בסיומו של מהדק אינסולין מוצעות (איור 6). זאת על מנת להבטיח רמות ההמטוקריט לא נופלים יותר מ -5% במהלך הניסוי ואת השינויים הנלווה של נפח הדם ואת זרימת אין השפעה סילוק הגלוקוז.
באיור 1. ניסיוני הגדרת. איור 1 מציג עכברוש מרוסן, מודע במהלך ההליך מהדק. צנתרים לאפשר דגימה דם חליטות ללא טיפול בבעלי חיים. משאבות שמאלה מכילים אינסולין וגלוקוז.
t ">
איור 2. הצפוי נתונים במהלך ההליך מהדק. כדי לקבל מהדק ברמות הבסיס (euglycemia, 5 מ"מ), רמות של גלוקוז אקסוגניים (D50) הם מניפולציה עד הבסיס או "מלחציים" מושגת.
איור 3. הצפוי הגלוקוז בפלסמה תוצאות ההליך מהדק. כאשר בעל חיים הוא "הידק", רמת הסוכר בדם יציבות יחסית לאורך זמן קבוצות הניסוי.
איור 4. הנציג עירוי גלוקוז שיעורי ההליך מהדק. כמות הגלוקוז אקסוגניים נדרשות לשמור euglycemia שונה. זו באה לידי ביטוי עם שלט (צ'או נמאס) גבוהה שומן נמאס (עמידות לאינסולין) בעלי חיים. החיה גבוה שומן נמאס דורש גלוקוז פחות רווי לשמור על הגלוקוז, בעיקר משום שהוא חסר רגישות האינסולין רווי.
איור 5. אינסולין פלזמה נציג של החולדה. אינסולין פלזמה במהלך מהדק את האינסולין צריך להיות גבוה יותר מאשר האינסולין, צם פלזמה המחקר. זה מבטיח אינסולין היה מנוהל כראוי החיה במהלך מהדק את האינסולין.
איור 6. דיווח המטוקריט. המטוקריט המחקר ולאחר המטוקריט בעקבות הניסוי יש לקבל ודיווח. הדבר מבטיח רמות ההמטוקריט לא נופלים יותר מ 5% מן הרמה הבסיסית הנובעת הדגימה יתר הדם בעורקים.