מודל זרימת הלוחה המקבילה במבחנה לחקר הידבקות חיידקית בביופסיית רקמה

תקציר

מקור: דיטקובסקי, ב. ואחרים. מודל Invitro של מערכת פרפוזיה מקבילה לחקר היצמדות חיידקית לרקמות השתלות. J. Vis. Exp. (2019).

סרטון זה מדגים את השיטה לשימוש בתא זרימה מקביל לפרפיוז חיידקים מסומנים פלואורסצנטי מעל רקמות השתל הוסקולרי, ומאפשר ניתוח מבוקר של הידבקות חיידקית ופתוגנזה מוקדמת בתנאי זרימה גזירה.

פרוטוקול

כל ההליכים הכוללים דגימות בעלי חיים נבדקו ואושרו על ידי ועדת האתיקה המתאימה לבעלי חיים.1. ניסויי פרפוזיה במבחנה באמצעות תא זרימה מקביל

1. התקן ביופסיות רקמה בקוטר 10 מ"מ ובעובי זהה למערכת תא זרימה כאשר הפנים הפנימיות פונות כלפי מעלה כדי להגיע למגע עם המתלה החיידקית.
   הערה: אותו עובי רקמה בין השתלים השונים מבטיח שגובה הרקמה באותו גובה בתעלה, מה שמאפשר זרימה למינרית בכל התנאים. כל מרכיבי תא הזרימה מוצגים ומתוארים באיור 1.
   1. כדי להתחיל את הפרוטוקול, הניחו את חתיכת הרקמה העגולה בין סלייד מיקרוסקופ עם חור עגול בקוטר 8 מ"מ ואטם גומי.
      הערה: למחסנית המיקרוסקופ יש סרט תחתית דק במיוחד שמאפשר יצירת חור בגודל 8 מ"מ. יחד עם יריעת הגומי, הוא מקבע את הרקמה כדי לאפשר מגע ישיר בין הדגימה למדיום הזורם וגם מונע את ניתוק הביופסיה במהלך הניסוי. פני השטח של הרקמה הנחקרת, החשופים לזרימה (קוטר קטן יותר), אינם ניתנים למניפולציה על ידי המלקחיים.
      1. הכנס את המחזיק עם הרקמה לתוך גיליון האטמים המוטמע במסגרת המתכת התחתונה של התא.
      2. חבר את המסגרת המתכתית העליונה עם יריעת האטמים המתאימה לחלק התחתון של התא באמצעות מחזיק הרקמה שהוכנס קודם. לאחר מכן מתקינים את כל התא עם שמונה ברגים ואומים. ודא שגובה התא תמיד זהה בין השתלים.
         הערה: גובה התא צריך להיקבע תמיד בעת הידוק הברגים. השתמש בקליפר או בסרגל.
2. חבר את תא הזרימה עם משאבה פריסטלטית ואת מיכל הנוזלים עם הצינורות.
3. הפירו את הרקמות עם תליות של 10⁷ CFU/mL (מאומת על ידי ספירת CFU (יחידת יצירת מושבה) וקשורות למדידות OD₆₀₀ (צפיפות אופטית)) חיידקים מסומנים פלואורסצנטי ב-PBS (מלח עם בופר פוספט) עם מאמץ גזירה של 3 דיין/ס"מ² (דיין ליחידת לחץ של סנטימטר רבוע) באמצעות משאבת פריסטלטית (קצב זרימה 4 מ"ל/דקה) למשך שעה באמצעות מאגר חיידקים של 400 מ"ל (עיצוב פנימי, איור 1) מותנה בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס באמצעות תרמוסטט לוחית (טבלת חומרים).
4. מחזור מחדש ברציפות את תליית החיידקים של 100 מ"ל באמצעות אותו מאגר איסוף.
5. לאחר הפרפוזיה, פירקו את התא לשחרור השתל ושוטפים את חתיכת הרקמה פעמיים עם 4 מ"ל PBS בלוח של 12 בארות באמצעות שייקר אורביטלי מעבדה למשך 3 דקות כל אחד. לאחר מכן חתכו את החלק הפנימי של השתל באמצעות מאגר ביופסיה בעור בקוטר קטן יותר.
6. הניחו כל ביופסיית רקמה בצינור נפרד בנפח 14 מ"ל המכיל 1 מ"ל של NaCl סטרילי 0.9%. תתייג את הצינור כ-#1.
7. נתק את החיידקים מהרקמה באמצעות אמבטיית סוניקציה למשך 10 דקות (משרעת = 100% ותדירות = 45 קילוהרץ).
   הערה: יש להעריך ניתוק מלא של חיידקים מהשתלים בעת דגירה של הטלאים במהלך הלילה בטמפרטורה של 37°C במדיום נוזלי TSB (ציר סויה טריפטית), ולאחר מכן מדידות OD₆₀₀ בהשוואה למדבקות ביקורת שטופלו בתמיסה נטולת חיידקים.

תוצאות

איור 1: תמונה של מערכת תא זרימה חדשה שפותחה (עיצוב פנימי). A. תא הזרימה (1) הותקן עם סט זרימה במידות LxWxH: 125 מ"מ x 55 מ"מ x 18 מ"מ (ברגים בשילוב עם ברגים-אגומים מחזיקים את חלקי התא יחד ומפעילים לחץ דרך מסגרת המתכת על האטמים למניעת...

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה

שם	חברה	מספר קטלוג	הערות
טלאי פריקרדיום בקר (BP), פריקרדיום פריגארד גמיש	Synovis Surgical Innovations, ארה"ב	PC-0404SN
תעלות ורידים ג'וגולריים בקריים (BJV)	צינור קונטגרה; מדטרוניק בע"מ, ארה"ב	M333105D001
הומוגרפט קריופרשמור CH	הבנק האירופי להומוגרפט (EHB)	-
אקו-פאנץ'	אקודרם בע"מ, ארה"ב	P850 (8 מ"מ); P1050 (10 מ"מ)
האלבומין האנושי	פלקסבומין; בקסטר, בלגיה	BE171464LOT:16G12C
מרק סויה טריפטי (TSB)	פלוקה, שטיינהיים, גרמניה	22092-500G
מרק עירוי לב (BHI)	פלוקה	53286-500G
תמיסת מלח עם בופר זרחן (PBS).	גיבקו	14190-094
5(6)-קרבוקסיפלואורסאין N-הידרוקסיסוקסינימיד אסטר (CF)	סיגמא-אלדריך, גרמניה	21878-100MG-F
משאבה פריסטלטית (דגם ISM444B)	Ismatec BVP-Z Standard; קול פארמר, וורטהיים, גרמניה	631942-2
אמבט סוניקציה	VWR Ultrasonic Cleaner; VWR, רדנור, פנסילבניה	142-6044	230V/50 -60Hz 60VA; HF45kHz, 30W
מתקן אנטי-פייד ProLong Gold	Invitrogen מאת ThermoFisher	P36930
אריום פרו VF - מים אולטרה-טהורים - H2O MilliQ	מיליפור	87206462
שקופיות מיקרוסקופיות - תאי תרבית רקמה (באר אחת)	סארסטדט	94.6140.102
באר 1 על לומוקס ניתנת לניתוק	סארסטדט	94.6150.101
פלדת אל-חלד - להבים כירורגיים	סוואן-מורטון	311
צינורות סיליקון טייגון, 1/8" ID x 1/4" OD	קול-פרמר	EW-95702-06	טווח טמפרטורות: –80 עד 200°CS סטריליזציה: עם אתילן אוקסיד, קרינת גמא או אוטוקלאב למשך 30 דקות, לחץ של 15 psi
צינורות PharMed BPT	סן-גובן	AY242012	אוטוקלבר 30 דקות ב-121°C
צינורות טייגון LMT-55	Saint Gobain Performance Plastics™	15312022
תרמוסטט	BMG BIOMEDIZINTECHNIK	300-0042	230V, 90VA, 50Hz