אריזת פסאודו-וירוס באמצעות טרנספקציית סידן-פוספט הכינו תרחיפי תאים בודדים של תאי HEK293FT (בצפיפות של 9 x 10^5 למ"ל) בתווך DMEM (Dulbecco's Modified Eagle Medium) מלא (טבלה 1). הוסיפו 10 מ"ל מהתרחף התאים הבודדים לבקבוק T75, והדגרימו את התאים באינקובטור בטמפרטורה של 37 °C ובריכוז של 5% פחמן דו-חמצני (CO2) למשך 20 שעות לפני הטרנספקציה. הערה: מומלץ להשתמש בתאי HEK293FT במעבר נמוך (פחות מ-20 מעברים). ודאו ששכבת התאים (monolayer) הגיעה ל-80-90% התמזגות (confluency). החליפו את התווך ב-10 מ"ל של תווך מלא טרי המכיל כלורוקווין (100 µM), שעתיים לפני הטרנספקציה. ערבבו את הרכיבים ואת ה-DNA הפלסמי כפי שמוצג בטבלה 2 ובאיור 1: ddH2O (מים מזוקקים פעמיים), pCMV/R-HA, pCMV/R-NA, pHR-Luc, pCMV Δ8.9, CaCl2 (סידן כלוריד) בריכוז 2.5 M, ובאפר 2x HEPES (4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazineethanesulfonic acid). העבירו את הנוזל עם פיפטה למעלה ולמטה בעדינות 5 פעמים; הדגירו את התערובת בטמפרטורת החדר (RT) למשך 20 דקות. העבירו את התערובת אל התווך שמעל התאים, ונערה את הבקבוק בעדינות. הדגימו את התאים באינקובטור למשך 15 שעות. החליפו את התווך ב-15 מ"ל של תווך DMEM מלא טרי. הדגימו את התאים באינקובטור בטמפרטורה של 37 °C ובריכוז של 5% CO2 למשך 65 שעות. הערה: צבע התווך יהיה כתום בהיר או צהוב בהיר, ולפחות 80% מהתאים צריכים להראות אפקט ציטופתי (CPE) תחת מיקרוסקופ אור הפוך. אספו את העל-נוזל (supernatant), וסובבתו בצנטריפוגה ב-2095 x g למשך 20 דקות בטמפרטורה של 4 °C. אספו את העל-נוזל, חלקו אותו לאליקוטים ואחסנו אותו בטמפרטורה של -80 °C. טבלה 1: הרכב תווך DMEM מלא. הרכב תווך DMEM מלא | ריכוז --- | --- Dulbecco’s Modified Eagle Medium (DMEM) | 1x סרום בקר עוברי (Fetal bovine serum) | 10% פניצילין (1 U/mL)/סטרפטומייצין | 1 μg/mL טבלה 2: מערכת אריזה של פסאודו-וירוס. חומרים | ריכוז | נפח --- | --- | --- 2x HEPES (pH 7.1) | -- | 675.0 μL CaCl2 (2.5 M) | -- | 67.5 μL ddH2O | -- | 529.2 μL pCMV Δ 8.9 | 1000 ng/μL | 18.9 μL pCMV/R-HA | 100 ng/μL | 27.0 μL pCMV/R-NA | 50 ng/μL | 13.5 μL pHR-Luc | 1000 ng/μL | 18.9 μL צ'אנג, X., ושותפיוהכנת נגיפי שפעת עופות H5 פסאודו-טיפייד (Pseudo-Typed) בשיטת טרנספקציה של סידן-פוספט ומדידת פעילות נטרול של נוגדנים. .J. Vis. Exp (2021)
סרטון זה מדגים את ייצורם של פסאודו-וירוסים של שפעת בתאי אדם באמצעות טרנספקציית פלסמיד המתווכת על ידי סידן-פוספט, המאפשרת ייצור בטוח של חלקיקים ויראליים למחזור אחד עבור יישומים המשכיים כגון בדיקות נטרול נוגדנים תחת תנאי רמת בטיחות ביולוגית 2 (BSL-2).
