גידול נגיפי וטכניקות

Source: Tang, N., et al. Generating Recombinant Avian Herpesvirus Vectors with CRISPR/Cas9 Gene Editing. J. Vis. Exp. (2019)This video demonstrates the clonal isolation and PCR-based screening of recombinant herpesvirus following site-specific excision of a GFP marker. Fluorescence-activated cell sorting is used to isolate non-fluorescent infected cells, and junction PCR confirms retention of the target gene in GFP-negative clones.

Source: Cross, T., et al. An Optimized Enrichment Technique for the Isolation of Arthrobacter Bacteriophage Species from Soil Sample Isolates. J. Vis. Exp. (2015).This video demonstrates the isolation of Arthrobacter bacteriophages from a soil sample using enrichment and plaque assay techniques. It highlights the infection, amplification, and visualization of phages as clear lysis zones formed on a bacterial lawn.

Source: Morales Vasquez, D., et al. Live Imaging and Quantification of Viral Infection in K18 hACE2 Transgenic Mice Using Reporter-Expressing Recombinant SARS-CoV-2. J. Vis. Exp. (2021)This video demonstrates the protocol for carrying out plaque assay–based viral titration for quantifying infectious virus levels in tissue sample collected from a virus–infected mouse model.

Source: Vijayraghavan, S., Kantor, B. A Protocol for the Production of Integrase-deficient Lentiviral Vectors for CRISPR/Cas9-mediated Gene Knockout in Dividing Cells. J. Vis. Exp. (2017).This video demonstrates the procedure for generating recombinant viral particles by transfecting embryonic kidney cells with plasmids encoding viral proteins and a gene of interest.

Source: Rustad, M., et.al. Synthesis of Infectious Bacteriophages in an E. coli-based Cell-free Expression System. J. Vis. Exp. (2017)This video demonstrates the purification of bacteriophages from a suspension containing host bacterial debris using a sucrose density gradient. It shows how the density gradient separates phages by buoyant density, enabling recovery of a visible band for resuspension and further analysis.

Source: Brauer, R. et al., Influenza Virus Propagation in Embryonated Chicken Eggs. J. Vis. Exp. (2015)This video demonstrates the synthesis and harvest of the influenza virus in fertilized chicken eggs. The virus is inoculated into the allantoic cavity, where it replicates in epithelial cells and buds into the allantoic fluid, which is then collected and stored for downstream applications.

Source: Nguyen, H., et al. Growth, Purification, and Titration of Oncolytic Herpes Simplex Virus. J. Vis. Exp. (2021).This video demonstrates the propagation and harvesting of oncolytic herpes simplex virus in mammalian cell cultures, highlighting viral entry, replication, and the recovery of virus-loaded cells. It further shows methods for preserving infected cells for downstream processing.

Source: Nguyen, H., et al. Growth, Purification, and Titration of Oncolytic Herpes Simplex Virus. J. Vis. Exp. (2021)This video demonstrates the purification of an oncolytic virus from infected mammalian cell cultures using nuclease treatment, sequential centrifugation, membrane filtration, and sucrose cushion centrifugation.

Source: Huang, D., et al. Mosquito-Associated Virus Isolation from Field-Collected Mosquitoes. J. Vis. Exp. (2022).This video demonstrates the step-by-step procedure for the in vitro isolation of mosquito-associated viruses from mosquito homogenates using fibroblast-like mammalian cells.

Source: Eggers, C. H. Phage-Mediated Genetic Manipulation of the Lyme Disease Spirochete Borrelia burgdorferi. J. Vis. Exp. (2022).This video demonstrates the isolation of borrelial phage particles from a Borrelia burgdorferi suspension using polyethylene glycol-mediated phase separation. The sample is centrifuged, treated with a salt solution, and a molecular crowding agent to precipitate phages. Chloroform extraction is done to remove debris and concentrate phage particles. The purified phage...

Source: Pett, N., et al. T4 Bacteriophage and E. coli Interaction in the Murine Intestine: A Prototypical Model for Studying Host-Bacteriophage Dynamics In Vivo. J. Vis. Exp. (2024)This video demonstrates the purification of bacteriophages from bacterial cell lysates using sequential centrifugation, membrane filtration, chloroform extraction, centrifugal filtration, and buffer exchange to obtain a purified phage preparation.

Source: Van Lidth de Jeude, et al. A Protocol for Lentiviral Transduction and Downstream Analysis of Intestinal Organoids. J. Vis. Exp. (2015).This video demonstrates the process of producing viral particles through transfection of embryonic kidney cells with plasmid–polyethylenimine complexes, which leads to viral genome expression, particle assembly, and virus collection in the medium.

Source: Saragliadis, A., et al. Producing Gene Deletions in Escherichia coli by P1 Transduction with Excisable Antibiotic Resistance Cassettes. J. Vis. Exp.(2018)This video demonstrates preparation of a bacteriophage lysate containing transducing particles. A donor strain is infected, plaques form, and the soft agar overlay is processed with chloroform to yield a clarified lysate for downstream analysis.

יום או יומיים לפני האלקטרופורציה, הכין בקבוק T182 אחד של תאי Vero (ניתן להשתמש בבקבוקים בין T150 ל-T182; גידול ב-Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) + 10% סרום בקר עוברי (FBS)) עבור כל מבנה (construct) שיש להצילה. כלול בקבוק T182 אחד כביקורת טרנספקציה מדומה (mock). יש להשתמש בתאים כאשר הם נמצאים ב-70-80% התלכדות (confluency).

הכינו שני טיפים של פיפט בעלי פיה רחבה על ידי הסרת 2-4 מ"מ מקצה של טיפ בנפח 20 µL באמצעות תער או להב סכיפה חדשים על משטח נקי.

הערה: יש לבצע את שלבים 1.1–1.3 בתוך קבינה לבטיחות ביולוגית. בפרט, טיפול בתעליל התרבית המכיל נגיף זיהומי חייב להתבצע בסביבה ברמת בטיחות ביולוגית 2 (או גבוהה יותר).

מקור: .Dembowski, J. A ואחריםטיהור של DNA נגיפי לצורך זיהוי חלבונים נגיפיים ותאיים נלווים. J. Vis. Exp. (2017).סרטון זה מדגים את בידודם של קומפלקסים של חלבון-DNA ויראלי מגרעיני תאים באמצעות כימיית קליק (click chemistry) וטיהור באמצעות חרוזי מגנט. הפרוטוקול כולל סימון של גנומים ויראליים באמצעות נוקלאוטידים שעברו מודיפיקציה של אלקין, ביוטינילציה באמצעות תגובת קליק, וקישור לחרוזי מגנט מצופים בסטראפטווידין. לאחר שטיפה ואלוציה תרמית, הקומפלקסים המטוהרים נאספים, עוברים הקפאה מהירה ומאוחסנים לצורך...

מקור: Ding, J. et. al., הכנת rAAV9 לביטוי יתר או השתקה של גנים בלבבות עכברים. J. Vis. Exp. (2016)סרטון זה מציג את טהרתם של חלקי נגיף רקומביננטיים מתאי כליה אנושיים שעברו טרנספקציה. הנגיף משתחרר על ידי ליזיס בהקפאה והפשרה ומטוהר באמצעות מדרגי יודיקסנול עם סינון בסיוע פולימר בלוק-קופולימר.

קציר AAV (נגיף אדנו-אסוציאטיבי) וליזיס כימית של תאי HEK293 (תאי כליה עובריים אנושיים 293) שעברו טרנספקציה. נער את תא תרבית התאים בעוצמה כדי לשחרר את התאים עד שהמדיום נראה עכור מהתאים ששוחררו, ומזוג לארבעה מבחנות צנטריפוגה של 500 מ"ל. צנטריפוג את המבחנות במהירות של 18,000 x g למשך 30 דקות בטמפרטורה של 4 °C כדי לשקע את התאים. מזוג את העלייה המזוקקת לבקבוק PETG (פוליאתילן טרפתלאט קופוליאסטר) בנפח של 1 ליטר. הערה: אם אין גישה לצנטריפוגה מהירה, בצע צנטריפוגה במהירות של 12,000 x g למשך 40 דקות. ייתכן...

הפשיר משקע חיידקי אחד על קרח.

מקור: Vijayraghavan, S. ו-Kantor, B. פרוטוקול להפקה של וקטורים לנטיביריאליים חסרי אינטגראז עבור השתקת גנים באמצעות CRISPR/Cas9 בתאים מתחלקים. .J. Vis. Exp, (2017)סרטון זה מדגים שיטת אולטרסנטריפוגציה בשני שלבים המשתמשת במדרגי סוכרוז ובכריות סוכרוז כדי לטהר ולרכז חלקיקים ויראליים מתוצר לוואי של תרבית תאים. הפרוצדורה מאפשרת הפרדה המבוססת על צפיפות ציפה, ובכך מאפשרת השבה של וירוס שלם המתאים ליישומים המשכיים.

כרומטוגרפיית זיקה להפרין. הכין 250 מ"ל של Buffer C (50 mM tris(hydroxymethyl)aminomethane hydrochloride (Tris-HCl), pH 7.5, 10 mM dithiothreitol (DTT), 0.1 mM ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA), 500 μM phenylmethylsulfonyl fluoride (PMSF)) ו-250 מ"ל של Buffer D (50 mM Tris-HCl, pH 7.5, 10 mM DTT, 0.1 mM EDTA, 500 μM PMSF, 1 M NaCl). הערה: בפרוטוקול זה, מערכת הכרומטוגרפיית נוזלים מהירה של חלבונים (FPLC), הבאפרים והדגימה נשמרים בחדר קירור בטמפרטורה של 4 ˚C. סנן באופן סטרילי את Buffers C ו-D...

הומגניזציה של גופים שלמים של *H. vitripennis* חיוביים לנגיף בבופר פוספט, pH ~7.2, עם 0.02% sodium diethyldithiocarbamate trihydrate (DETCA), באמצעות וורטקס במרווחי זמן של כ-10 שניות עד שלא יישארו גושי רקמה גדולים. מיצוי הנגיף יתבצע באמצעות סנטריפוגה במהירות גבוהה (superspeed centrifugation) ב-124,500 x g למשך 4 שעות ב-4 °C או ב-22,000 x g למשך 16 שעות ב-4 °C. אם נוצר משקע בחלק העליון, יש להסירו באמצעות מקלון צמר סטרילי. יש להשליך את הנוזל העליון (supernatant).

מקור: Sahmi-Bounsiar, D. et al. מיקרו-שאיבה של תא בודד כאסטרטגיה חלופית למיון תאים מופעל פלואורסצנציה להפרדת תערובות של וירוסים ענקיים. J. Vis. Exp. (2019)סרטון זה מדגים מיקרו-שאיבה של תא בודד (single-cell micro-aspiration) לצורך בידוד והרחבה של אוכלוסיית וירוס ענק בודדת מתוך אוכלוסייה נגיפית מעורבת, תוך שימוש באמבות כתאי מאכסן.

מקור: Bou Khalil, J. Y.,et al. אסטרטגיה מהירה לבידוד Faustoviruses חדשים מדגימות סביבתיות באמצעות Vermamoeba vermiformis. J. Vis. Exp. (2016)סרטון זה מדגים העשרה של וירוסים ענקיים מדגימת מים סביבתית באמצעות תרבית משותפת (co-culture) מבוססת אמבה, כדי לאפשר זיהוי ואנליזה בשלבים הבאים.

נגב את שטח העבודה בתמיסת אקונומיקה/אתנול ביחס של 1:1.

מקור: Gao, Y., et al. יצירה והרכבה של נוקלאוקפסيدات ספציפיות לנגיף של נגיף הסינציטיומ של דרכי הנשימה. J. Vis. Exp. (2021)הסרטון מדגים הרכבה in vitro של נוקלאוקפסيدات ספציפיות לנגיף מקומפלקס מטהר של נוקלאופרוטאין-פוספופרוטאין נטול RNA, את טיהורן באמצעות כרומטוגרפיית החרגתו גודל, ואימות של RNA ויראלי באורכו המלא בתוך החלקיקים המורכבים.

מקור: Fricano-Kugler, C. J., ואחרים. תכנון, אריזה והחדרה של רטרו-וירוסים ולנטי-וירוסים בטיטר גבוה המעבירים CRISPR באמצעות הזרקה סטריאוטקסית. J. Vis. Exp. (2016).סרטון זה מדגים את התהליך שלב אחר שלב לריכוז וטיהור של חלקיקי לנטי-וירוס מתליה מעורבת המכילה שרידי תאי מאחס. הפרוצדורה משתמשת בצנטריפוגה, סינון והשקעה של PEG-מלח כדי לבודד את החלקיקים הוויראליים תוך הסרת זיהומים מסיסים. המוצר הסופי מומס מחדש בבופר ונשמר בטמפרטורות נמוכות במיוחד כדי לשמור על הזיהומיות הוויראלית ועל השלמות המבנית.

Source: Rustad, M. et al. Synthesis of Infectious Bacteriophages in an E. coli-based Cell-free Expression System. J. Vis. Exp. (2017)This video demonstrates the amplification and recovery of infectious bacteriophages from E. coli cultures. It outlines the steps for plaque isolation, phage replication, controlled lysis, and purification.

Source: Wang, M., et al, Evaluation of T Follicular Helper Cells and Germinal Center Response During Influenza A Virus Infection in Mice. J. Vis. Exp. (2020).This video demonstrates intranasal infection of a mouse with a pathogenic influenza virus to establish a respiratory tract infection. The procedure outlines the administration of the virus into the nasal cavity. The virus enters host cells, replicates, and activates the immune system.

Source: Asad, S., et al. Quantification of Antibody-dependent Enhancement of the Zika Virus in Primary Human Cells. J. Vis. Exp. (2019)This video demonstrates antibody-dependent enhancement of Zika virus infection in human primary macrophages, using dengue antibody–virus complexes to model how cross-reactive antibodies facilitate Fcγ receptor–mediated viral entry and replication for studying infection mechanisms and immune interactions.

Source: Klaus, J. P., et al Highly Sensitive Assay for Measurement of Arenavirus-cell Attachment. J. Vis. Exp. (2016).This video demonstrates how to measure arenavirus attachment to monkey kidney cells. The assay uses low temperatures to block endocytosis and isolate the virus binding step. The approach enables precise quantification of surface-bound virus particles under conditions that restrict internalization.

Source: Fernández-Fernández, R., et. al. Bacteriophage Removal from Infected Salmonella Cultures. J. Vis. Exp. (2024)This video demonstrates the use of exogenous LPS (Lipopolysaccharide) as a receptor mimic to inactivate lytic bacteriophages in Salmonella cultures. Through sequential incubation, centrifugation, and washing, phages are eliminated, resulting in a viable, phage-free bacterial suspension for downstream applications.

ביצוע בדיקת VbMS מבוססת PVX בצמחי תפוח אדמה. השתילו צמחי תפוח אדמה בני 4 שבועות שגודלו בתרבית (in vitro) לתוך קרקע. הצמחים המשתולים יעברו בדיקת VbMS כעבור 3–4 ימים. הדביקו את צמחי תפוח האדמה ב-Agrobacterium המכילה פלסמידי PVX-STTM (Short Tandem Target Mimic). הערה: עבור בדיקת VbMS בתפוח אדמה, חלחול בתיווך Agrobacterium והדבקה באמצעות שריטות בקיסם מבוצעים בו-זמנית. בחרו והדביקו טרנספורמנטים חיוביים המכילים וקטורי PVX-STTM לתוך 50 מ"ל של מצע LB נוזלי המכיל 50 מק"ג/מ"ל קנמיצין ו-50 מק"ג/מ"ל...

ספרו את התאים באמצעות המוציטומטר, ולאחר מכן השקיעו 50,000 תאים (800 x g למשך 5 דקות ב-23 °C) לכל באר המיועדת לבדיקה (הן עבור תאי התורם והן עבור תאי המטרה). השביו 1 x 10⁶ תאים/מ"ל בתווך RPMI (Roswell Park Memorial Institute) מלא ללא puromycin. בצלחת אחת, הוסיפו 25 µL של ת сусפנזיית תאי התורם לכל באר; בצלחת אחרת, הוסיפו 25 µL של תאי מטרה. לכל באר, הוסיפו 25 µL של תרכובת הבדיקה המדוללת בתווך RPMI מלא בריכוז המתאים. דגרו את תאי התורם ותאי המטרה עם התרכובת למשך 30 דקות.

מקור: Yates, J. G. E., ואחרים. ייצור של נגיף מחלת ניוקאסל רקומביננטי בתרC גבוה מנוזל אלנטואיס. .J. Vis. Exp (2022)הסרטון מדגים את טהרתם וריכוזן של חלקי וירוס מנוזל אלנטואיס מזולל שנאסף מביצי תרנגולת עם עובריים נגועי וירוס. הוא מציג סדרה שלבי סינון והפרדה, הכוללים סינון עומק (depth filtration), סינון זרימה מומסית (tangential flow filtration) ואולטראצנטריפוגה במדרג צפיפות להבדיל וירוסים שלמים. הפракציה העשירה בווירוסים עוברת לאחר מכן דיאליזה להסרת מלחים שאריתיים ומרכיבי מדרג באמצעות דיפוזיה,...

הדבקה של תרביות ממשק אוויר-נוזל (ALI)...

מקור: Krishnamurthi, R., ואחריםהבנת ההשפעה של בקטריופאגים מתונים על הליסוגנים שלהם באמצעות טרנסקריפטומיקה. J. Vis. Exp. (2024)סרטון זה מדגים את השראת השכפול הליטי של פרופאג המשולב בגנום החיידקי ואת לכידת השינויים בביטוי הגנים באמצעות דגימה מתוזמנת לצורך אנליזה טרנסקריפטומית.

מקור: Ruiz, A. J. and Russell, S. J. בקרה מבוססת microRNA של טרופיזם של Picornavirus. .J. Vis. Exp (2017)סרטון זה מדגים את השימוש במימיקים סינתטיים של microRNA כדי לעכב באופן סלקטיבי רפליקציה נגיפית בתאים דמויי-אפיתל בתרבית. הסרטון מדגיש כיצד השתקה של הגנום המכוונת על ידי microRNA יכולה לחסום את התפשטות הנגיף ולאשר את ספיציפיות המטרה באמצעות ניתוח זיהומיות במורד המסלול.

גדלו תאי HEK-293T בטמפרטורה של 37 °C וב-5% CO2 במצע Dulbecco's modified Eagle's medium (DMEM) עם L-glutamine מיוצב, בתוספת 10% סרום עגל עוברי (FCS), סטרפטומייסין (100 μg/ml) ופניצילין (100 IU/ml). את התאים מעבירים למצע חדש (passage) על ידי טריפסינציה כל 4-5 ימים, בדילול של 1:10 לבקרה נקייה. התאים צריכים להיות בשלב הלוגריתמי (log phase) עבור הניסויים.

מקור: Heidbuechel, J. P., ושותפיהםParamyxoviruses לאימונומודולציה המכוונת לגידולים: תכנון והערכה ex vivo. .J. Vis. Exp. (2019).סרטון זה מדגים בדיקה מבוססת תאים להערכת הפעילות האימונומודולטורית הספציפית למטרה של bispecific T-cell engager (BTE) המקודד באופן ויראלי. ה-BTE מקשר בין תאי גידול המבטאים רספטור מטרה לבין תאי T, ובכך מעורר ליזיס של הגידול ושחרור אנזימים. קריאה קולורימטרית, המבוססת על המרת סובסטרט, מעידה על הפעלת תאי T. עוצמת צבע גבוהה יותר בדגימת הבדיקה מאשרת מעורבות חיסונית תלוית-רספטור...

מקור: Kalveram, B., et al. שימוש בכימיית קליק למדידת השפעת זיהום נגיפי על סינתזת RNA בתא המאכסן. J. Vis. Exp. (2013)סרטון זה מדגים את השימוש בכימיית קליק (click chemistry) ובציטומטריה של זרימה כדי למדוד דיכוי של שעתוק בתאי מאחס המושרה על ידי נגיף. תאי יונקים מודבקים בנגיף המבטא חלבון ארגס (virulence protein) גרעיני המשבש את קומפלקס גורמי השעתוק של המאחס, בעוד שתאי בקרה נשארים פעילים מבחינת שעתוק. שילוב של 5-ethynyl uridine מסמן mRNA שסונתז לאחרונה, מה שמאפשר כימות של הפעילות השעתוקית בתאים...

מקור: קיארלה, א. מ. וכו' ,.et al דיכוי שעתוק גנים באמצעות הפנייה מחדש של המכניקה התאית באמצעות משנים אפיגנטיים כימיים. .J. Vis. Exp (2018)סרטון זה מדגים יצירת תאי גזע עובריים של עכבר שעברו מודיפיקציה גנטית באמצעות טרנסדוקציה לנטיBיראלית. חלקיקים לנטיBיראליים מעבירים סמן לעמידות לאנטיביוטיקה, מה שמאפשר אינטגרציה גנומית יציבה וברירה של תאים שעברו טרנסדוקציה.

מקור: Fuchs, M. ואח'. אדנופקציה: שיטה לחקר תפקידם של מלווים מולקולריים (Molecular Chaperones) במורפודינמיקה תאית באמצעות ניסויי דלל-הצלה (Depletion-Rescue). J. Vis. Exp. (2016)סרטון זה מדגים הובלה באמצעות אדנווירוס של טרנסגן פלואורסצנטי בשילוב עם טרנספקציית siRNA–calcium phosphate בתאי סרטן של צוואר הרחם. האדנווירוס מבטא חלבון מחליף פלואורסצנטי, בעוד שה-siRNA משרה דגרדציה ממוקדת של mRNA באמצעות קישור ל-RISC. קו-טרנספקציה רצפית זו מאפשרת knockdown סימולטני של החלבון האנדוגני והצלה (rescue)...

הדבקת תאי פיברובלסטים עובריים של עכבר (MEF) וכימות ציטוקינים באמצעות ELISA ו-qRT-PCR ז'אנג, J., ואח'ניתוח של סיגנלינג במערכת החיסון המולדת בהתחמקות נגיפית מייצור ציטוקינים. J. Vis. Exp. (2014)סרטון זה מדגים את תהליך ההדבקה של תאי פיברובלסט עכבריים בנגיף הרפס והניטור של שחרור ציטוקינים אנטי-ויראליים וביטוי גנים הנובעים מכך. הוא מפרט שלבים מרכזיים, הכוללים הדבקה נגיפית, איסוף מדיום לכימות ציטוקינים וקצירת תאים לצורך אנליזה של ביטוי גנים.

Source: Zhang, L., et al. Immunofluorescent Labeling of Plant Virus and Insect Vector Proteins in Hemipteran Guts. J. Vis. Exp. (2021)The video demonstrates the preparation of gut tissue from a plant virus–infected insect vector for fluorescence imaging. Fixed guts were washed, permeabilized, and incubated with two fluorescent antibodies in a blocking solution—one targeting a viral antigen in vesicles, the other a vesicle-associated membrane protein. The tissue was counterstained for actin...

Source: Schaeffer, J. W., Chandler, et al. Detection of Viruses from Bioaerosols Using Anion Exchange Resin. J. Vis. Exp. (2018).This video demonstrates the detection of viruses from bioaerosols using an anion exchange resin. A liquid impinger containing the resin is used to capture viruses from the air. The resin is collected and treated with a virus lysis buffer containing carrier RNA. The lysate is transferred to a microcentrifuge tube for viral RNA isolation, followed by qRT-PCR to amplify...

Source: Yuan, M., et al. A Simple and Efficient Approach to Construct Mutant Vaccinia Virus Vectors. J. Vis. Exp. (2016)This video demonstrates the process of performing a fluorescent plaque assay using recombinant vaccinia virus encoding red fluorescent protein (RFP) in fibroblast cells, followed by plaque isolation and purification for further analysis.

Source: Williams, S. M. et al. Novel Atomic Force Microscopy Based Biopanning for Isolation of Morphology Specific Reagents against TDP-43 Variants in Amyotrophic Lateral Sclerosis. J. Vis. Exp. (2015)This video demonstrates tapping-mode AFM to visualize phage–antigen interactions on a mica surface. It outlines the steps for antigen immobilization, phage binding, and high-resolution nanoscale imaging.

Source: DeMarino, C., et al. Purification of High Yield Extracellular Vesicle Preparations Away from Virus. J. Vis. Exp. (2019)The video demonstrates the separation of EVs from virions and other contaminants by density gradient centrifugation, followed by capture and concentration with hydrogel nanoparticles. Washed fractions are then ready for downstream identification of those enriched in EVs.

Source: Van Lidth de Jeude, J. F., et al. A Protocol for Lentiviral Transduction and Downstream Analysis of Intestinal Organoids. J. Vis. Exp. (2015).This video demonstrates the processing of lentivirus-transduced mouse intestinal organoids for paraffin embedding, to enable their downstream analysis for assessing gene expression.

Source: Chen, H. et. al. Live Cell Imaging of the TGF-β/Smad3 Signaling Pathway In Vitro and In Vivo Using an Adenovirus Reporter System. J. Vis. Exp. (2018)This video demonstrates the preparation of luciferase-expressing breast cancer cells using recombinant adenoviruses for in vivo imaging.

Source: Ren, S., et al. A Protocol for Analyzing Hepatitis C Virus Replication. J. Vis. Exp. (2014).This video demonstrates an immunofluorescence-based method to detect Hepatitis C virus replication in infected hepatoma cells. The protocol involves cell fixation, antibody staining for viral protein and double-stranded RNA, and visualization using fluorophore-tagged secondary antibodies. Dual signal detection under a fluorescence microscope confirms active viral replication within the host cells.

Source: Stauffer, S. et al. In Vitro Disassembly of Influenza A Virus Capsids by Gradient Centrifugation. J. Vis. Exp. (2016)This video demonstrates the pH-dependent disassembly of influenza A virus (IAV) cores using gradient ultracentrifugation. It outlines glycerol gradient preparation, ultracentrifugation, and how different pH conditions affect IAV core disassembly.

Source: Philip, A. A., et al., Simplified Reverse Genetics Method to Recover Recombinant Rotaviruses Expressing Reporter Proteins. J. Vis. Exp. (2020)This video demonstrates the isolation of rotavirus double-stranded RNA from clarified cell lysates. It further illustrates the separation and visualization of genome segments through polyacrylamide gel electrophoresis.

Source: Philip, A. A., et. al., Simplified Reverse Genetics Method to Recover Recombinant Rotaviruses Expressing Reporter Proteins. J. Vis. Exp. (2020)This video demonstrates a plaque assay technique to monitor rotavirus infection in epithelial cells. Trypsin activation enhances viral entry, and staining highlights viable cells, enabling visualization of infection-induced plaques.

Source: Stauffer, S. et al., In Vitro Disassembly of Influenza A Virus Capsids by Gradient Centrifugation. J. Vis. Exp. (2016)This video demonstrates the effect of pH on the solubilization of influenza A viral cores. Gel electrophoresis and protein staining reveal the progressive disassembly of the core structure under acidic conditions.

Source: Moore, M. D., et al. Alternative In Vitro Methods for the Determination of Viral Capsid Structural Integrity. J. Vis. Exp. (2017)The video demonstrates a protocol for monitoring the heat-induced aggregation of virus-like particles using dynamic light scattering (DLS). It begins with preparing a monodisperse suspension of purified particles. The sample is then loaded into a preheated DLS instrument. As the capsid proteins denature with heat, exposed hydrophobic regions cause particle...

Source: Tran, B. N., et. al. High-throughput Confocal Imaging of Quantum Dot-Conjugated SARS-CoV-2 Spike Trimers to Track Binding and Endocytosis in HEK293T Cells. J. Vis. Exp. (2022)This video demonstrates the use of quantum dot–conjugated spike protein (QD-Spike) to visualize dose-dependent viral entry in ACE2-GFP–expressing cells. Confocal imaging captures the internalization of QD-Spike via receptor-mediated endocytosis, modeling early coronavirus entry.

Source: Mateer, E., et al., Confocal Imaging of Double-Stranded RNA and Pattern Recognition Receptors in Negative-Sense RNA Virus Infection. J. Vis. Exp. (2019)This video demonstrates the confocal imaging of viral double-stranded RNA (dsRNA) and cytoplasmic pattern recognition receptors (PRRs) in virus-infected epithelial cells. It highlights how antibody-based fluorescent labeling reveals the interaction between viral replication intermediates and host immune sensors.

Source: Xu, C., et al. An Efficient and Simple Method to Establish NK and T Cell Lines from Patients with Chronic Active Epstein-Barr Virus Infection. J. Vis. Exp. (2018).This video demonstrates the phenotyping of EBV-infected T and NK cell lines using flow cytometry, highlighting the preparation, antibody staining, and analysis steps to identify lineage-specific surface markers. It shows how marker profiles confirm distinct T-cell and NK-cell populations.

Source: Cross, T., et al. An Optimized Enrichment Technique for the Isolation of Arthrobacter Bacteriophage Species from Soil Sample Isolates. J. Vis. Exp.(2015)This video demonstrates the isolation of bacteriophages from a soil sample. A soil sample is collected and suspended in a phage buffer and allowed to settle the sediment. The extract is filtered, and nutrients are added. A vacuum filtration is done to remove microbial contaminants. The filtrate with phages is aliquoted into flasks, and...

Source: Allaire, A., et al. Immunofluorescence to Monitor the Cellular Uptake of Human Lactoferrin and its Associated Antiviral Activity Against the Hepatitis C Virus. J. Vis. Exp. (2015).The video demonstrates the procedure for preparing cells to assess the intracellular uptake and activity of an antiviral agent against the hepatitis C virus.

Source: Olety, B., et. al., Visualization of HIV-1 Gag Binding to Giant Unilamellar Vesicle (GUV) Membranes. J. Vis. Exp. (2016)This study demonstrates a fluorescence-based assay to observe the membrane-binding behavior of human immunodeficiency virus type-1 structural protein. Using synthetic giant unilamellar vesicles as model membranes, the assay visualizes protein recruitment and assembly, mimicking early steps of viral particle formation.

Source: Lê-Bury, G., et al. Phagosome Migration and Velocity Measured in Live Primary Human Macrophages Infected with HIV-1. J. Vis. Exp. (2016)This video demonstrates live confocal imaging of HIV-1-infected human macrophages to visualize and quantify phagosome migration using GFP fluorescence and bright field tracking, providing insights into how HIV alters intracellular trafficking during Fc receptor–mediated phagocytosis.

מקור: ווקה, א. , ואחרים. שימוש בווירוס אדנו-אסוסיאטיבי (Adeno-associated Virus) ככלי למחקור מחסומי רשתית במחלה. .J. Vis. Exp (2015)סרטון זה מדגים את הפרוצדורה השלבית להכנת חתכים קפואים (cryosections) של רשתית עכבר, לצורך ויזואליזציה של חדירותיות של וירוס אדנו-אסוציאטיבי (adeno-associated virus) דרך מחסומי רשתית פגועים.

השג רשתות עם שכבת תמיכה מפחמן (ניקל) המיועדות ל-TEM.

2. צביעה גרעינית: צביעת נגד של הגרעינים לאחר הצביעה האימונוהיסטוכימית. שפוך את ה-PBST ומרח DAPI (4',6-diamidino-2-phenylindole) או צבע גרעיני לפי הבחירה למשך דקה אחת בטמפרטורת החדר. שטוף את הפיתה פעמיים ב-PBS למשך 10 דקות בטמפרטורת החדר תוך ניעור. Shah, R., ואחריםדימוי פלואורסצנציה רב-ערוצי ברמה התאית להדמיית חומצות גרעין וחלבונים נגיפיים ולניטור זיהומים של HIV, HTLV, HBV, HCV, נגיף זיקה ושפעת. J. Vis. Exp. (2020)סרטון זה מדגים ויזואליזציה סימולטנית של DNA, RNA וחלבון הקפסיד של HIV-1...

מקור: Pohl, M. O. & Stertz, S. מדידת היצמדות והפנמה של נגיף השפעת A בתאי A549 באמצעות ציטומטריית זרימה. J. Vis. Exp. (2015)סרטון זה מדגים את השימוש במבחן חסימה של סטרפטאווידין כדי להבחין בין נגיף השפעת קשור לפני השטח לבין נגיף שהופנם לתאי אפיתל של ריאה אנושית. השוואה בין אותות פלואורסצנציה מראה כי עוצמה גבוהה יותר לאחר אינקובציה מעידה על הפנמה ויראלית מוצלחת.

מקור: Niu, Y. D., ואחרים. הערכת יעילותם של בקטריופאגים לבקרת ביולוגית של פתוגנים המועברים במזון באמצעות מערכים לסריקה רב-מסית. J. Vis. Exp. (2021)סרטון זה מדגים בדיקה מבוססת מיקרופלטה להערכת הפעילות הליטית של תערובות פאג'ים נגד תרביות חיידקי E.coli. הוא מדגיש כיצד שינויים בצפיפות האופטית חושפים את עוצמת הפאג'ים ואת הריכוז הדרוש לעיכוב חיידקי...

מקור: Dembowski, J. A., Deluca, N. A. טיהור של DNA נגיפי לזיהוי של חלבונים נגיפיים ותאיים נלווים. J. Vis. Exp. (2017)סרטון זה מדגים הדבקה של תאי יונקים בשלב סטציונרי ב-HSV-1 (Herpes Simplex Virus-1), ולאחריה שכפול של הגנום הוויראלי באמצעות מנגנוני השכפול של המארח והווירוס. אנלוג נוקלאוזידי סינתטי נטמע ב-DNA ויראלי שסונתז לאחרונה כדי לסמן גנומים בשכפול, אשר מבודלים לאחר מכן לצורך אנליזה פרוטאומיקה של חלבוני המארח והווירוס הקשורים אליהם.

ייצור רחב-היקף של וקטור ויראלי המופק מנגיפי adeno-associated (וקטור...

לאחר הזיהוי הראשוני על השקופיות, העריך את נוכחותו של הוירוס הענק באמצעות תצפית במיקרוסקופ אלקטרוני של תרביתי העל.

מקור: Vallery, T. K. & Steitz, J. A. היברידיזציה פלורסצנטית באתר (FISH) כמותית ואימונופלורסצנציה (IF) של תוצרי גנים ספציפיים בתאים נגועי KSHV. .J. Vis. Exp (2019)סרטון זה מדגים היברידיזציה פלואורסצנטית באתר (FISH) להדמיית RNA ויראלי בתאים נגועים בנגיף. הוא מפרט את השלבים הכרוכים בהיברידיזציה של גששים, הגברה של האות והדמיה קונפוקלית.

מקור: Rghei, A. D., ואחריםייצור של וקטורים של נגיף אדנו-אסוסיאטיבי (AAV) במגשיי תרבית רב-שכבתיים (Cell Stacks) עבור מחקרים פרה-קליניים במודלים של בעלי חיים גדולים. J. Vis. Exp. (2021)הסרטון מדגים טיהור של וקטורי נגיף אדנו-אסוסיאטיבי (AAV) רקומביננטיים מליזט גס של תאי המאחסן באמצעות מטריצת זיקה מבוססת הפרין. חלקיקים נגיפיים נקשרים להפרין שאינו נייד, בעוד שזיהומים נשטפים החוצה. בופר בעל ריכוז מלח גבוה משחרר נגיפים שלמים, אשר נאספים בפרקציות מועשרות. פרקציות אלו מרוכזות באמצעות סבוב צנטריפוגלי של...

הפרידו תאי HeLa מהפלטה ודללו במצע גידול (Dulbecco's Modified Eagle Medium [DMEM], 2 mM L-glut, 10% סרום בקר עוברי [FBS]) לריכוז של כ-2.0 x 10⁵ תאים/מ"ל. העבירו 100 מיקרוליטר לבאר בפלטה של 96 בארות בעלת דפנות שחורות ותחתית שקופה ושטוחה (20,000 תאים לבאר). דגרו את התאים למשך 24 שעות עד להגעה לקונפלואנציה באינקובטור בטמפרטורה של 37 °C ו-5% CO2.

לפני בידוד של ויריונים בודדים באמצעות ציטומטריה של זרימה, הכינו תרחיפי נגיפים שאינם מקובעים. בודדו חלקיקי נגיפים באמצעות פרוטוקולים שהוגדרו בעבר, תוך וידוא שהתרחיף הנגיפי הסופי נמצא ב-TE (Tris-EDTA, pH 8) מסונן ב-0.1 μm. אנו ממליצים להשתמש בגישות של סינון זרימה טנגנציאלי (TFF), אם כי פותחו שיטות אחרות המשתמשות בקוואגולציה כימית. ספרו את חלקיקי הנגיפים באמצעות פרוטוקולים מקובלים, לדוגמה באמצעות אפי-פלואורסנציה או ציטומטריה של זרימה. חלקו את התרחיף הנגיפי לשתי מבחנות Eppendorf (הנפח הסופי המומלץ...

מקור: Kalveram, B. et al. שימוש בכימיית קליק למדידת השפעת זיהום נגיפי על סינתזת RNA של תא המאחסן. J. Vis. Exp. (2013)סרטון זה מדגים את השימוש בכימיית קליק (click chemistry) ובמיקרוסקופיית פלואורסצנציה כדי להדמיות של שעתוק RNA ראשוני (nascent RNA) בתאי יונקים. הוא מדגיש כיצד זיהום נגיפי מדכא את השעתוק של תא המאחס באמצעות השוואת אותות פלואורסצנציה בין תאים מזוהמים לתאי ביקורת.

מקור: מרזוק, נ. ב., וכולם, מתודולוגיה ליצירה יעילה של חלבוני נגיף וקסיניה (vaccinia virus) מסומנים פלואורסצנטית. .J. Vis. Exp (2014)סרטון זה מדגים את יצירתם של נגיפי vaccinia רקומביננטיים באמצעות רקומבינציה הומולוגית מתווכת-פלסמיד בתאי אפיתל נגועים. סמנים פלואורסצנטיים ומטבוליים מאפשרים את הבחירה והזיהוי של נגיפים המבטאים חלבונים מסומנים.

מקור: Blancett, C. D., ואח'שימוש בקפסולות לצביעה שלילית של דגימות נגיפיות בתוך הכלה ביולוגית. J. Vis. Exp. (2017).סרטון זה מדגים הכנה בטוחה של דגימות נגיף עבור מיקרוסקופיה אלקטרונית חודרת (TEM). חלקיקי הנגיף מקובעים באמצעות glutaraldehyde, נצבעים בחומר בעל צפיפות אלקטרונית גבוהה, ועוברים קיבוע באדי osmium tetroxide כדי לייצב את המבנים ולהבטיח אינאקטיבציה מלאה, ובכך להבטיח טיפול בטוח בדגימות נגיף תוך שיפור הניגודיות לצורך הדמיית TEM באיכות גבוהה.

מקור: Contreras, D., ואחריםמערכת תרביות תאים מזוהמות בנגיף זיקה והשפעה מניעתית של אינטרפרונים במבחנה. J. Vis. Exp. (2016)הסרטון מדגים את הגילוי של תוצרי ביניים של dsRNA של נגיף זיקה בתאי אפיתל נגועים באמצעות אימונוציטוכימיה. תאים נגועים מקובעים ולאחר מכן נחסמים באמצעות תמיסת חסימה. מוסיפים נוגדנים ראשוניים ושניוניים. הגרעינים נצבעים בצבע פלואורסצנטי. ה-dsRNA הנגיפי המסומן נצפה לאחר מכן תחת מיקרוסקופ פלואורסצנטי.

Source: Rustad, M., et al. Synthesis of Infectious Bacteriophages in an E. coli-based Cell-free Expression System. J. Vis. Exp. (2017).This video demonstrates the synthesis of bacteriophages using a cell-free transcription–translation (TXTL) system. A master mix is prepared using a bacterial crude extract, an energy mix, an amino acid mix, an inhibitor for a DNA-degrading enzyme, and bacteriophage DNA, then incubated. The in vitro molecular machinery enables viral protein expression and DNA...

Source: Jamieson, T. R., et al. Detection of SARS-CoV-2 Neutralizing Antibodies using High-Throughput Fluorescent Imaging of Pseudovirus Infection. J. Vis. Exp. (2021)This video demonstrates the procedure for infecting mammalian cells with green fluorescent protein (GFP)-encoding pseudovirus, monitoring viral replication and spread by fluorescence microscopy, and collecting virus-containing supernatant for downstream applications.

Source: Yuan, M., et al. A Simple and Efficient Approach to Construct Mutant Vaccinia Virus Vectors. J. Vis. Exp. (2016)This video demonstrates the expansion of plaque-derived recombinant virus in adherent mammalian cells. The virus carries a fluorescent reporter in place of a virulent gene, enabling infection tracking. Infected cells are harvested for PCR verification of the genetic modification.

Source: Liu, P., et al. Use of a Recombinant Mosquito Densovirus As a Gene Delivery Vector for the Functional Analysis of Genes in Mosquito Larvae. J. Vis. Exp. (2017).This video demonstrates the process of isolating recombinant Aedes aegypti densovirus (rAaeDV) from infected mosquito-derived epithelial cells. The infected cells are collected and exposed to repeated freeze-thaw cycles for lysis. Lysate is centrifuged, and the supernatant containing viral particles is filtered, aliquoted, and...

Source: Philip, A. A., et al. Simplified Reverse Genetics Method to Recover Recombinant Rotaviruses Expressing Reporter Proteins. J. Vis. Exp. (2020)This video demonstrates the recovery of recombinant rotavirus by transfecting plasmids encoding viral genome segments into hamster kidney cells, followed by amplification in monkey epithelial cells, enabling studies of rotavirus biology, replication, and vaccine development.

Source: Prasad, M. et al. In Vitro Establishment of a Genetically Engineered Murine Head and Neck Cancer Cell Line using an Adeno-Associated Virus-Cas9 System. J. Vis. Exp. (2020)This video demonstrates the in vitro transformation of murine epithelial cells through viral delivery of Cre recombinase and mutation-inducing components. It outlines the steps for Cas9 activation, cancer-gene modification, and the establishment of a tumorigenic murine cell line.

Source: Ehrke-Schulz, E., et al. Cloning and Large-Scale Production of High-Capacity Adenoviral Vectors Based on the Human Adenovirus Type 5. J. Vis. Exp. (2016)This video demonstrates the large-scale amplification of high-capacity adenoviral vectors in suspension-adapted human embryonic kidney cells expressing Cre recombinase for use in gene delivery applications requiring high-titer, helper-free vector preparations.

הכינו תרחיפי תאים בודדים של תאי HEK293FT (בצפיפות של 9 x 10^5 למ"ל) בתווך DMEM (Dulbecco's Modified Eagle Medium) מלא (טבלה 1). הוסיפו 10 מ"ל מהתרחף התאים הבודדים לבקבוק T75, והדגרימו את התאים באינקובטור בטמפרטורה של 37 °C ובריכוז של 5% פחמן דו-חמצני (CO2) למשך 20 שעות לפני הטרנספקציה.

מקור: ליו, פ', ואחריםשימוש בנגיב דנסו של יתושים רקומביננטי כווקטור להעברת גנים לצורך ניתוח פונקציונלי של גנים בזחלי יתושים. J. Vis. Exp. (2017)סרטון זה מדגים את השימוש בנגיפי דנסו (densoviruses) רקומביננטיים של יתושים המקודדים ל-microRNA לצורך השתקה של גנים ספציפיים בזחלי יתושים. זחלים נגועים בשלב מוקדם של ההתפתחות מייצרים microRNAs תפקודיים המדכאים את ביטוי הגן מטרה לצורך מחקרים המשכיים.

מקור: Eggers, C. H. מניפולציה גנטית בתיווך פאגים של הספירוכטה הגורמת למחלת הלייים Borrelia burgdorferi. J. Vis. Exp. (2022).סרטון זה מדגים טרנסדוקציה של ספירוכטות Borrelia שעברו שינוי גנטי באמצעות בקטריופאגים לא-זיהומיים שהשקיעו ב-polyethylene glycol ונושאים פלסמיד לעמידות לקנמיצין. לאחר דגירה עם החיידקים, התרבית נזרעה על מצע המועשר באנטיביוטיקה. רק תאים שקיבלו את הפלסמיד שורדים ויוצרים מושבות. מושבות אלו נבחרות לאחר מכן ומורחבות במצע נוזלי המכיל אנטיביוטיקה כדי לבסס אוכלוסיית חיידקים יציבה...

זריעה של 1.0 - 1.5 x 105 תאי MDA-MB-231 עם 500 μL של מצע תרבית dulbecco’s modified eagle medium (DMEM) המכיל 5% סרום בקר עוברי (FBS) בכל באער של פלטת 12 באערים (35% התמסכנות תאים, 2 באערים בסך הכל).

מקור: Meister, T. L., ושותפיהם מודל תרבית תאים להפקת מאגרי נגיף ההפטיטיס E בריכוז גבוה. J. Vis. Exp. (2020).סרטון זה מדגים את תהליך בידוד החלקיקים של נגיף ההפטיס E (HEV) מתאי קרצינומה של תאי כבד אנושיים שעברו טרנספקציה. חלקיקים ויראליים חוץ-תאיים נאספים מנוזלים עליונים מסוננים, בעוד שחלקיקים תוך-תאיים משוחררים על ידי חשיפת התאים למספרי מחזורי הקפאה-הפשרה חוזרים. הליזט עובר צנטריפוגציה, והנוזל העליון המכיל חלקי HEV מחולק למנות ונשמר בטמפרטורה נמוכה במיוחד לשימוש...

מקור: Ehrke-Schulz, E., ואחריםשיבוט וייצור בקנה מידה גדול של וקטורים אדנו-ויראליים בעלי קיבולת גבוהה המבוססים על אדנו-וירוס אנושי מסוג 5. J. Vis. Exp. (2016)סרטון זה מדגים את טהרתם של וקטורים אדנו-ויראליים בעלי קיבולת גבוהה באמצעות אולטרסנטריפוגציה במדרג צסיום כלוריד, המאפשרת הפרדה של ויריונים המכילים גנום לצורך יישומים בהעברת גנים, אפיון וקטורים ומחקרים טיפוליים...

הערה: יש לאחסן אדנו-וירוס רקומביננטי או וירוס אדנו-אסוסיאטיבי (AAV) המבטא את הגן מטרה ואת וירוס הבקרה המתאים, כגון Ad-GFP (חלבון פלואורסצנטי ירוק) (טיטר של 1 x 10^10 יחידות יוצרי פלאק [PFU]/מ"ל) או AAV9-GFP (טיטר של 1 x 10^13 עותקי גנום [GC]/מ"ל) (ראה טבלת חומרים), במקפיא של 80°C-.

כוונן את תמיסת וקטור הנגיף האסוסיאטיבי (AAV) לריכוז סופי של 2.7 x 10¹³ גנומי וקטור ב-5 מ"ל על ידי הוספת הנפח המתאים של תמיסת סליין עם בופר פוספט (PBS). נתק את הכבד ממעגל המדיום על ידי הסרת הצינורית מהקנולה. חבר מזרק של 5 מ"ל לקנולה של הווריד השער (portal vein) והזרק את כל תמיסת וקטור ה-AAV (5 מ"ל).

מקור: קוזה, פ., ואח׳ יצירת חולדות טרנסגניות באמצעות גישת וקטור לנטי-ויראלי. J. Vis. Exp. (2020)סרטון זה מדגים החדרה של וקטורים לנטיביריאליים לעוברים מופריים של חולדה באמצעות מיקרו-הזרקה, על מנת להשיג אינטגרציה יציבה של טרנסגן ליצירת חולדות טרנסגניות.

ייצור הווירוס המרוכז (איור 1A,...

מקור: Heidbuechel, J. P., Engeland, C. E. פראמיקסו-וירוסים לאימונומודולציה ממוקדת גידולים: תכנון והערכה Ex Vivo. J. Vis. Exp. (2019)סרטון זה מדגים את יצירתם של נגיעי חצבת רקומביננטיים באמצעות ליפוזומים להחדרת פלסמידים המקודדים את האנטי-גנום הנגיפי וחלבונים עזריים חיוניים לתוך תאי ייצור. ה-RNA המשוכתב והמשוכפל מוביל ליצירת חלקיקים נגיפיים המבטאים חלבונים מעוררי מערכת חיסונית וחלבונים פלואורסצנטיים למעקב. לאחר מכן נעשה שימוש במיקרוסקופיה פלואורסצנטית כדי להדמות היווצרות של סינציטיה (syncytia),...

מקור: בוליאר, C. ואחרים., הגברה ותיתור של נגיפי סינציטיום נשימתי (RSV) רקומביננטיים. .J. Vis. Exp (2019)סרטון זה מדגים את יצירת נגיף נשימתי סינציטיאלי (RSV) רקומביננטי המבטא חלבון פלואורסצנטי ירוק (GFP) באמצעות מערכת גנטיקה הפוכה מבוססת T7. טרנספקציה משותפת של פלסמידים המקודדים לחלבונים ויראליים ושל גנום מתויג ב-GFP מובילה לביטוי חלבון ומניעה את הצלת הנגיף.

הפק תמלילי T7-RNA עם כיסוי (capped) מפלסמידי וקטור המבוססים על Potato virus X (PVX) הנושאים גנים של חלבון מעטפת (CP) מסוג פרא (wild-type, wt) וגנים עם מוטציית ציסטאין של Maize rayado fino virus (MRFV), באמצעות ערכת T7-mMessage mMachine של Ambion.

מקור: צ'ן, ז', וחב' יצירת חלקיקים דמויי נגיף (Virus-like Particles) פלואורסצנטיים שעברו פגילציה (PEGylation) באמצעות צימוד המונחה על ידי כימיית דיברומומאליימיד-דיסולפיד. .J. Vis. Exp (2018)סרטון זה מדגים פונקציונליזציה פלואורסצנטית של חלקיקים דמויי נגיף על ידי חיבור מחדש של גשרי דיסולפיד מרופחים באמצעות מקשר פוליאתילן גליקול (PEG), ליצירת קונג'וגטים יציבים וניתנים למעקב המתאימים לדימוי תאי ומסירה ממוקדת ביישומים ביו-רפואיים.

מקור: יוון, ס'. ועמיתיהםכרומוזומים מלאכותיים חיידקיים: כלי גנומיקה פונקציונלית לחקר וירוסי RNA בעלי גדיל חיובי. J. Vis. Exp. (2015)סרטון זה מדגים את השחזור של נגיף דלקת המוח היפנית (Japanese encephalitis virus) זיהומי מ-RNA סינתטי שהועתק משכפול של כרומוזום מלאכותי בקטריאלי. הוא מראה כיצד תאים עוברים אלקטרופורציה עם ה-RNA הסינתטי, מה שמאפשר לגנום הנגיפי להנחות את ייצורם של ויריונים חדשים. הפלאקים שנוצרו בשכבות התאים המอดูהים מאשרים את השחזור המוצלח של נגיף זיהומי.

Source: Chang, X., et al. Preparation of Pseudo-Typed H5 Avian Influenza Viruses with Calcium Phosphate Transfection Method and Measurement of Antibody Neutralizing Activity. J. Vis. Exp. (2021)This video demonstrates a luciferase-based pseudovirus titration assay to determine the optimal target cell density for maximum infection. By comparing luminescence across cell densities, the method ensures high assay sensitivity and reproducibility for downstream applications.

Source: Chang, X., et al. Preparation of Pseudo-Typed H5 Avian Influenza Viruses with Calcium Phosphate Transfection Method and Measurement of Antibody Neutralizing Activity. J. Vis. Exp. (2021).This video demonstrates a luciferase-based assay to quantify pseudovirus infection in epithelial cells. The pseudovirus encodes the luciferase gene, which is expressed in infected cells. After washing, and cells are incubated with lysis buffer at an ultra-low temperature, and then thawed to induce lysis.

Source: Klaus, J. P. et al. Highly Sensitive Assay for Measurement of Arenavirus-cell Attachment. J. Vis. Exp. (2016)This video demonstrates the extraction of viral RNA from surface-bound virions on epithelial cells using silica spin columns. The method includes chemical lysis, RNA stabilization, and membrane-based purification for downstream quantification of virus-cell attachment.

Source: Ren, S., et al. A Protocol for Analyzing Hepatitis C Virus Replication. J. Vis. Exp. (2014).This video demonstrates the procedure for quantifying Hepatitis C viral RNA using quantitative reverse transcription PCR to measure viral load in infected cell cultures.

Source: Kadoya, S., Sano, D. Assays for the Specific Growth Rate and Cell-binding Ability of Rotavirus. J. Vis. Exp. (2019).This video demonstrates the use of a plaque assay to assess the rotavirus growth curve. The method involves infecting host cells with diluted virus, overlaying with agarose to restrict spread, and staining to visualize plaques formed by viral replication. By counting plaque-forming units at defined time points, the resulting growth curve reveals the lag, exponential, and...

Source: Fout, G. S., Cashdollar, J. L. EPA Method 1615. Measurement of Enterovirus and Norovirus Occurrence in Water by Culture and RT-qPCR. II. Total Culturable Virus Assay. J. Vis. Exp. (2016)This video demonstrates the use of a total culturable virus assay to quantify infectious viruses in water samples. It outlines host cell inoculation, observation of cytopathic effect, and statistical quantification of infectious virus concentration.

Source: Scarborough, R. J., et al. Evaluation of the Efficacy And Toxicity of RNAs Targeting HIV-1 Production for Use in Gene or Drug Therapy. J. Vis. Exp. (2016).This video demonstrates a reverse transcriptase (RT) assay to assess the effect of a test RNA on virus-like particle (VLP) production. Cells are co-transfected with plasmids, and RT activity is measured as a quantitative indicator of VLP output. A decrease in RT activity reflects suppression of viral gene expression by the test RNA.

Source: Manocheewa, S., et al. Pairwise Growth Competition Assay for Determining the Replication Fitness of Human Immunodeficiency Viruses. J. Vis. Exp. (2015)The video demonstrates the procedure for a growth competition assay to measure the relative replication fitness of two viral strains by comparing their replication in human immune cells.

מקור: ויג'יירגהבן, ס., ועוד. פרוטוקול להפקה של וקטורים לנטיביריים חסרי אינטגראז עבור השתקת גנים באמצעות CRISPR/Cas9 בתאים מתחלקים. J. Vis. Exp. (2017).סרטון זה מדגים את השימוש ב-p24 ELISA להערכת טירים ויראליים של וקטורים לנטי-ויראליים. הבדיקה כוללת ליזיס של חלקיקים ויראליים לשחרור p24, לכידה שלו באמצעות נוגדנים ספציפיים, וזיהויו באמצעות מערכת המקושרת לפרוקסידאז המייצרת שינוי צבע מדיד. על ידי השוואת ערכי הבליעה של הדגימה לעקומה סטנדרטית, ניתן לכמת את הטיר הויראלי.

מקור: .Krishnamurthi, R ועוד. הבנת ההשפעה של בקטריופאגים מיתונים על הליסוגנים שלהם באמצעות טרנסקריפטומיקה. J. Vis. Exp. (2024).סרטון זה מדגים את הספירה הזמנית של השראה ספונטנית של פאגים ב- Pseudomonas aeruginosa ליסוגני, באמצעות כימות תאי חיידקים חיים (CFUs) וחלקיקי פאג זיהומיים (PFUs) לאורך זמן. על ידי דגימה במרווחי זמן מוגדרים במהלך הגדילה וניתוח של היווצרות מושבות ופלאקים, השיטה חושפת מתי ההשראה הספונטנית היא מינימלית. דבר זה מאפשר זיהוי של נקודות זמן אופטימליות לניתוח טרנסקריפטומי המשכי עם...

Source: Frias-De-Diego and A., Crisci, E. Use of Crystal Violet to Improve Visual Cytopathic Effect-based Reading for Viral Titration using TCID50 Assays. J. Vis. Exp., (2022)This video demonstrates a crystal violet staining method to visualize cytopathic effects in virus-infected cell cultures. The pattern of stained and unstained wells across serial dilutions enables rapid, cost-effective estimation of the viral infectious dose.

מקור: Ren, S., וכולםפרוטוקול לניתוח רבייה של נגיף הפטיטיס C. J. Vis. Exp. (2014)סרטון זה מדגים את בדיקת מוקדי הפלואורסצנציה (fluorescence focus assay) המשמשת לכימות נגיפי Hepatitis C זיהומיים בתרבית תאים. הסרטון מדגים את הדילול הסידורי של העליון הנגיפי, את הדבקת תאי ההפטומה ואת זיהוי אתרי השכפול הנגיפי באמצעות מיקרוסקופיה פלואורסצנטית מבוססת נוגדנים.

מקור: Bouillier, C., ועמיתיהם יצירה, הגברה ותיתור של נגיפי סינציטיום נשימי (RSV) רקומביננטיים. .J. Vis. Exp (2019)הסרטון מדגים בדיקת טיטרציה של פלאקים (plaque titration assay) המשמשת לכימות של נגיף סינציטנלי נשימתי (RSV) רקומביננטי זיהומי בשכבות מונו-שכבה של תאי אפיתל. הוא מציג את הדבקת תאי המאכסן באמצעות תרחיפי נגיף בדילולים סדרתיים, את הגבלת התפשטות הנגיף על ידי שכבת כיסוי חצי-מוצקה מבוססת תאית, ואת היווצרות פלאקים מקומיים כתוצאה מאפקטים ציטופתיים. הפרוצדורה מסתיימת בצביעה, דה-קונטמינציה...

השג דגימות המכילות נגיף המבטא לוסיפראז (כאן VSV∆51-Fluc כדוגמה) לצורך מדידת תיתור (titration) והעברה לפלטות בעלות 96 בארות. לחלופין, בצע הדבקות בפלטות תרבית רקמה בעלות 96 בארות והשתמש בת上-סופרנטאטים באופן ישיר. השאר שתי עמודות ללא טיפול עבור הכללת עקומות סטנדרט. עבור ניסויים המבוצעים ישירות בפלטות בעלות 96 בארות, בצע תיתור בסוף הניסוי (40 שעות לאחר ההדבקה) או אחסן בטמפרטורה של 80- °C ובצע תיתור במועד מאוחר יותר.

מקור: .Baer, A. and Kehn-Hall, K. קביעת ריכוז נגיפי באמצעות בדיקות פלאק: שימוש במערכות כיסוי מסורתיות וחדשניות J. Vis. Exp. (2014).סרטון זה מדגים את השימוש בשכבת כיסוי נוזלית מבוססת תאית מיקרוקריסטלית בבדיקת פלאקים, על ידי השוואת יעילותה ביצירת פלאקים נגיפיים לעומת שכבת כיסוי מסורתית של אגרוז חצי-מוצק.