השתקה של miRNA מבוססת Potato Virus X בצמחי תפוח אדמה

תקציר

ביצוע בדיקת VbMS מבוססת PVX בצמחי תפוח אדמה. השתילו צמחי תפוח אדמה בני 4 שבועות שגודלו בתרבית (in vitro) לתוך קרקע. הצמחים המשתולים יעברו בדיקת VbMS כעבור 3–4 ימים. הדביקו את צמחי תפוח האדמה ב-Agrobacterium המכילה פלסמידי PVX-STTM (Short Tandem Target Mimic). הערה: עבור בדיקת VbMS בתפוח אדמה, חלחול בתיווך Agrobacterium והדבקה באמצעות שריטות בקיסם מבוצעים בו-זמנית. בחרו והדביקו טרנספורמנטים חיוביים המכילים וקטורי PVX-STTM לתוך 50 מ"ל של מצע LB נוזלי המכיל 50 מק"ג/מ"ל קנמיצין ו-50 מק"ג/מ"ל ריפמפיצין. גדלו באינקובטור בטמפרטורה של 28 °C במהירות של 220 rpm למשך 16 שעות עד ש-OD600 = 1.0. במקביל, פספסו את מושבות ה-Agrobacterium החיוביות על לפחות שתי צלחות LB חדשות המכילות 50 מק"ג/מ"ל קנמיצין ו-50 מק"ג/מ"ל ריפמפיצין וגדלו ב-28 °C למשך יום אחד. כללו את וקטור PVX-LIC כביקורת ואת PVX-GFP כדי לנטר את התפשטות הנגיף. אספו את תרבית ה-Agrobacterium הנוזלית על ידי סנטריפוגציה ב-3,400 x g למשך 10 דקות בטמפרטורת החדר. השביו את תאי ה-Agrobacterium בנפח שווה של באפר חלחול (10 mM MgCl2, 10 mM MES, ו-200 µM acetosyringone, pH = 5.6) וכוונו ל-OD600 = 1.0. דגרו בטמפרטורת החדר למשך 6 שעות. חלכלו את תרבית ה-Agrobacterium לצד האבכסלי (התחתון) של עלים רחבים ומפותחים במלואם באמצעות מזרק של 1 מ"ל ללא מחט. הפכו והחזיקו עלה ביד אחת, ולאחר מכן השתמשו באצבע אחת כדי לתמוך בלוח העלה מהצד האדכסלי (העליון) באתר החלחול. החזיקו את המזרק במצב אנכי לפני פני העלה ביד השנייה וחלכלו את תרבית ה-Agrobacterium לצד האבכסלי של לוח העלה. גרדו את תרבית ה-Agrobacterium ממוצאי צלחות ה-LB ושריטו את פני הגבעול של אחד או שניים מהמפרקים הראשונים של צמחי תפוח האדמה שחולכלו בעזרת קיסם. שריטו בעדינות את האפידרמיס של הגבעול. הימנעו מדקירה של הגבעול, שעלולה לגרום לנזק חמור לצמחים. גדלו את הצמחים שחולכלו בטמפרטורה של 22 °C עם פוטו-תקופה של 16 שעות אור/8 שעות חושך ועצימות אור של 120 μmol/m2∙ s1 בחממה. הערה: פנוטיפים הנגרמים על ידי השתקת miRNA מופיעים בדרך כלל 2–4 שבועות לאחר ההדבקה (איור 1, איור 2). בדרך כלל לוקח 10–20 ימים עד להופעת הפנוטיפ של VbMS לאחר החלחול. הפנוטיפ של VbMS תלוי בתכונות של ה-miRNA והגנים המטרה הספציפיים, בתנאי הגידול ובזני תפוח האדמה. ג'או, J., ואח'. השתקה של microRNA מבוססת Potato Virus X (VbMS) בתפוח אדמה. .J. Vis. Exp (2020).

סרטון זה מדגים את השימוש ב-Agrobacterium tumefaciens להחדרת מבנה המבוסס על Potato Virus X (PVX) לצמחי תפוח אדמה שגודלו בתרבית (in vitro), לצורך השתקה של microRNA מבוססת נגיף (VbMS). שיטה זו מאפשרת דיכוי סיסטמי של microRNA מטרה, ובכך מאפשרת לחוקרים לבחון את תפקידו בפיתוח הצמח באמצעות שינויים פנוטיפיים נצפים.

פרוטוקול

1. ביצוע בדיקת VbMS מבוססת PVX בצמחי תפוח אדמה.

1. השתילו צמחי תפוח אדמה בני 4 שבועות שגודלו in vitro לתוך קרקע. הצמחים המשתולים יעברו בדיקת VbMS כעבור 3–4 ימים.
2. חקו את צמחי תפוח האדמה באמצעות Agrobacterium המכיל פלסמידים מסוג PVX-STTM (Short Tandem Target Mimic).
   הערה: עבור בדיקת VbMS בתפוח אדמה, אינפילטרציה בתיווך Agrobacterium וחיסון באמצעות שריטות קיסם מבוצעים בו-זמנית.
   1. בחרו והחקירו טרנספורמנטים חיוביים המכילים וקטורי PVX-STTM לתוך 50 mL של מצע LB נוזלי המכיל 50 μg/mL kanamycin ו-50 μg/mL rifampicin. גדלו באינקובטור בטמפרטורה של 28 °C במהירות של 220 rpm למשך 16 h עד ש-OD₆₀₀ = 1.0.
   2. במקביל, רססו את מושבות ה-Agrobacterium החיוביות על לפחות שתי צלחות LB חדשות המכילות 50 μg/mL kanamycin ו-50 μg/mL rifampicin וגדלו בטמפרטורה של 28 °C למשך יום אחד. כללו את וקטור PVX-LIC כביקורת ואת PVX-GFP למעקב אחר התפשטות הנגיף.
   3. אספו את תרבית ה-Agrobacterium הנוזלית באמצעות סנטריפוגציה ב-3,400 x g למשך 10 min בטמפרטורת החדר. השהו מחדש את תאי ה-Agrobacterium בנפח שווה של באפר אינפילטרציה (10 mM MgCl₂, 10 mM MES, ו-200 µM acetosyringone, pH = 5.6) וכוונו ל-OD₆₀₀ = 1.0. דגרו בטמפרטורת החדר למשך 6 h.
   4. בצעו אינפילטרציה של תרבית ה-Agrobacterium לצד האבאַקסיאלי (התחתון) של עלים שהתרחבו במלואם באמצעות מזרק ללא מחט של 1 mL.
      1. הפכו והחזיקו עלה ביד אחת, ולאחר מכן השתמשו באצבע אחת כדי לתמוך בלומית העלה מהצד האדאַקסיאלי (העליון) באתר האינפילטרציה. החזיקו את המזרק בניצב לפני השטח של העלה ביד השנייה ובצעו אינפילטרציה של תרבית ה-Agrobacterium לצד האבאַקסיאלי של הלומית.
   5. גרדו את תרבית ה-Agrobacterium ממעל צלחות ה-LB ושריטו את פני השטח של הגבעול במיקום של המרווח בין-מפרקי (internodes) הראשון או השני של צמחי תפוח האדמה שעברו אינפילטרציה באמצעות קיסם. שריטו בעדינות את האפידרמיס של הגבעול. הימנעו מדקירה של הגבעול, דבר שעלול לגרום לנזק חמור לצמחים.
3. גדלו את הצמחים שעברו אינפילטרציה בטמפרטורה של 22 °C עם פוטו-פריודה של 16 h אור/8 h חושך ועצימות אור של 120 μmol/m²∙ s¹ בחממה.
   הערה: פנוטיפים הנגרמים על ידי השתקה של miRNA מופיעים בדרך כלל כעבור 2–4 שבועות לאחר החיסון (Figure 1, Figure 2). בדרך כלל נדרשים 10–20 ימים להופעת הפנוטיפ של VbMS לאחר האינפילטרציה. הפנוטיפ של VbMS תלוי בתכונות של miRNA הספציפי והגנים המטרה, בתנאי הגידול ובזני תפוח האדמה.

תוצאות

איור 1: VbMS של miR165/166 בזן תפוח האדמה הטטרהפלואידי Katahdin. פנוטיפים של צמחי תפוח אדמה (Katahdin) המבטאים את בקרת וקטור ה-PVX או PVX-STTM165/166. חצים מגנטה מציינים מבני עלים שנוצרו באופן אקטופי בעורקי העלה. ראש חץ כתום מציין מבני עלים ד...

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה

שם	חברה	מספר קטלוג	הערות
Agrobacterium tumefaciens strains: GV3101, GV2260 or EHA105.
Fertilizer: Peters Peat Lite Special 15-0-15 Dark Weather Feed	ICL Specialty Fertilizers, Summerville, SC 29483, USA	G99260
MgCl₂	ThermoFisher, Waltham, MA 02451, USA	MFCD00149781
PVX VIGS vector: PVX-LIC
Soil: Metro-Mix 360	Sun Gro Horticulture, Agawam, MA 01001-2907, USA	Metro-Mix 360
			Zhao et al., 2016