הכנת חתכי קריו של רשתית עכבר להערכת חדירות הרשתית לווירוס אדנו-אסוציאטיבי (Adeno-Associated Virus)

תקציר

מקור: ווקה, א. , ואחרים. שימוש בווירוס אדנו-אסוסיאטיבי (Adeno-associated Virus) ככלי למחקור מחסומי רשתית במחלה. .J. Vis. Exp (2015)

סרטון זה מדגים את הפרוצדורה השלבית להכנת חתכים קפואים (cryosections) של רשתית עכבר, לצורך ויזואליזציה של חדירותיות של וירוס אדנו-אסוציאטיבי (adeno-associated virus) דרך מחסומי רשתית פגועים.

פרוטוקול

כל ההליכים הכוללים דגימות מבעלי חיים נסקרו ואושרו על ידי ועדת האתיקה המתאימה לבעלי חיים. 

1. עבור חתכי קריו של הרשתית (איור 1), נתחו עיניים שהוצאו כדי להסיר את העדשה והקרנית, ובצעו קיבוע בטבילה ב-4% paraformaldehyde למשך שעה אחת.
   1. בצעו הגנה קריוגנית לעיניים שקובעו קודם לכן ב-10% sucrose למשך שעה אחת בטמפרטורת החדר, ולאחר מכן ב-20% sucrose למשך שעה נוספת בטמפרטורת החדר. בצעו הגנה קריוגנית בתמיסת 30% sucrose למשך לילה ב-4 °C. הקפיאו והטמיעו את כוסות העין (eyecups) בשרף הטמעה כגון Cryo-matrix. הכינו חתכי קריו בעובי 10 µm והניחו אותם על שקף שעבר טיפול מיוחד עבור חתכי רקמה קפואים, המשפר את היצמדות הרקמה במהלך הצביעה.
   2. בצעו פרמיאביליזציה לחתכים באמצעות 0.1% Triton X-10 בתוך phosphate-buffered saline (PBS) pH 7.4 למשך 5 דקות. שטפו פעמיים ב-PBS ובצעו חסימה (blocking) למשך שעה אחת בטמפרטורת החדר ב-PBS עם 1% bovine serum albumin (BSA) ו-0.1% Tween 20.

תוצאות

איור 1: ייצוג סכימטי של הפרוטוקול הכללי. לאחר ייצור וירוס אדנו-אסוסיאטיבי (AAV), מוזרקות חלקיקים לוויטריאוס או לווריד הפנילי להרדמת עכברים בוגרים. צילומי קרקעית בעזרת מצלמת Micron III מבוצעים כדי לעקוב אחר ביטוי של חלבון פלואורסצנטי ירוק (GFP). דפוס ביטוי ה-GFP מנותח בחתכי קריו של הרשתית וברשתית במבנה שטוח (flatmounted) באמצעות אימונוהיסטוכימיה ודימות קונפוקלי. מעבר ה-AAV דרך מחסום הדם-רשתית (BRB) מוערך באמצעות אנליזת תגובת שרשרת פולימראז (PCR) על דגימות דם מעכברים שהוזרקו באופן תוך-ויטריאלי או תוך-פריטוניאלי, וזאת כדי לזהות נוכחות של רצף GFP, המהווה אינדיקטור לנוכחות חלקי AAV בזרם הדם.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה

שם	חברה	מספר קטלוג	הערות
שרף להטמעה Cryomatrix	Thermo Scientific	676906
שקפים להדבקה Superfrost plus	Thermo Scientific	1014352
מגניפי בינוקולרי SZ76	ADVILAB	ADV-76B2	זום 0.6 x 5 x נורות LED עם מעמד epi ו-dia / דיסקציה של רשתית
מספרי קפיץ ישרים - 8.5 cm	Bionic France S.a.r.l	1503-08	דיסקציה של הרשתית