כל ההליכים הכרוכים בדגימות בעלי חיים נסקרו ואושרו על ידי ועדת אתיקה רלוונטית לבעלי חיים. 1. אימונוהיסטוכימיה עבור דגימות רשתית שטוחות (flatmounts) (איור 1), קבעו עיניים שהוצאו מהמחלול ב-4% פראפורמאלדהיד למשך 15 דקות כדי להקל על הניתוח. בתוך 15-30 דקות, נתחו את העיניים כדי להסיר את הקרנית ואת העדשה. הפרידו את הרשתית מהאפיתל הפיגמנטי של הרשתית (RPE) ומהסקלרה על ידי חיתוך מסביב ל-ora serrata ולעצב האופטי. טבלו ב-4% פראפורמאלדהיד למשך 30 דקות נוספות כדי לקבע את הרשתית ואת החלבון הפלואורסצנטי בתאי רשתית שעברו טרנסדוקציה (הקיבוע לא יעלה על 24 שעות). שטפו במשך 5 דקות ב-PBS סטרילי, pH 7.4. החליפו את התמיסה המלוחית עם חוצץ פוספט (PBS) בתמיסת חסימה (PBS עם 1% אלבומין מסרום בקר (BSA), 2% סרום נורמלי מעז או מחמור, 0.5% Triton X-100), והדגירו בתמיסת החסימה למשך 4 שעות בטמפרטורת החדר או למשך לילה ב-4°C. הדגירו את הרקמות עם נוגדנים ראשוניים בתמיסת חסימה למשך 4 שעות בטמפרטורת החדר או למשך לילה ב-4°C. שטפו 3 פעמים עם PBS. הערה: הנוגדנים שנעשה בהם שימוש הם כדלקמן: anti-laminin (1/1,000) המסמן את ה-ILM (הממברנות המגבילות הפנימיות), anti-rhodopsin clone 4D2 (1/500) המסמן תאי קולבנים (rods), anti-glutamine synthetase clone GS-6 (1/1,500) המסמן תאי מילר (Müller cells), ולקטין Peanut agglutinin (PNA) (1/40) המסמן תאי קונוסים. הדגירו את הרקמות עם דילול של 1:500 של נוגדנים שניים המשורשרים ל-alexa fluor בתמיסת חסימה למשך שעה אחת (בחתכים קריוגניים) או שעתיים (בדגימות שטוחות) בטמפרטורת החדר, תוך הגנה מאור. שטפו 3 פעמים עם PBS. בצעו חיתוכי שחרור ברשתית והניחו אותה בצורה שטוחה על תבנית זכוכית, כאשר צד הפוטורספטורים או צד תאי הגנגליון של הרשתית (RGC) פונים כלפי מעלה. הוסיפו מדיום קיבוע מימי, הניחו מכסיות זכוכית ושמרו ב-4°C. בצעו מיקרוסקופיה קונפוקלית במיקרוסקופ קונפוקלי עם סריקת לייזר. רכשו תמונות באופן רציף, שורה אחר שורה, כדי להפחית crosstalk של עירור ופליטה. הגדירו את גודל הצעד בהתאם למשפט הדגימה של ניקוויסט-שנון (Nyquist–Shannon). השתמשו בהגדרות חשיפה הממזערות פיקסלים רוויים מדי בתמונות הסופיות. עבדו תמונות של 12-ביט באמצעות FIJI, בצעו השלכה של חתכי Z למישור יחיד באמצעות אינטנסיביות מקסימלית תחת פונקציית Z-project, ובסוף המירו למצב צבע RGB של 8-ביט. וואקה, או., ואחריםשימוש בווירוס אדנו-אסוציאטיבי (Adeno-associated Virus) ככלי לחקר מחסומי הרשתית במחלה. J. Vis. Exp. (2015).
סרטון זה מדגים את שיטת העברת הגנים באמצעות AAV ברשתית של עכבר טרנסגני, ולאחריה דיסקציה של הרקמה וצביעה להערכת שלמות ממברנת הגבול הפנימית (inner limiting membrane).
