ייצור וניקוי של חלקיקי נגיף ההפטיס B רקומביננטיים

תקציר

הפקה של HBV (נגיף ההפטיטיס B) רקומביננטי המקודד את חלבון הדגל הכנת תאי HepG2 הכינו מצע גידול לתאים (מצע Dulbecco's modified Eagle's medium (DMEM) בתוספת 10% סרום בקר עוברי (FBS), 10 U/ml פניצילין, 10 µg/ml סטפטומייצין ו-10 U/ml חומצות אמינו לא חיוניות). זריעו 4 x 10⁶ תאי HepG2 (Human Hepatocellular Carcinoma G2) בצלחת בקוטר 10 ס"מ מצופה קולגן ב-10 מ"ל של מצע גידול, יום לפני הטרנספקציה. הדגירו את תאי ה-HepG2 בטמפרטורה של 37 °C באינקובטור לח עם 5% CO2. הערה: כאשר זורעים כ-4 x 10⁶ תאי HepG2 בצלחת בקוטר 10 ס"מ מצופה קולגן ב-10 מ"ל של מצע גידול, הם יגיעו ל-70-90% התלכדות (confluence) למחרת. טרנספקציה בצעו טרנספקציה לתאי HepG2 עם 5 µg של pUC1.2HBV delta epsilon15 (פלסמיד לשכפול HBV עם מחיקה ברצף האפסילון) ו-5 µg של pUC1.2HBV/NL15 באמצעות ריאגנט לטרנספקציה, בהתאם להוראות היצרן. למחרת, הסירו את מצע הגידול והוסיפו 10 מ"ל של מצע גידול טרי. שבוע לאחר הטרנספקציה, העבירו את מצע הגידול המכיל את ה-HBV הרקומביננטי למבחנה של 50 מ"ל והמשיכו לשלב 1.3.1. הוסיפו 10 מ"ל של מצע גידול טרי לצלחת המכילה את התאים שעברו טרנספקציה. הערה: הפקת ה-HBV הרקומביננטי נמשכת במשך 4 שבועות. ניתן לאחסן את מצע הגידול המכיל HBV רקומביננטי בטמפרטורה של 4 °C למשך חודש אחד. טיהור של HBV רקומביננטי הסירו שאריות תאים ממצע הגידול המכיל HBV רקומביננטי באמצעות סבוב בצנטריפוגה (2,300 x g למשך 5 דקות). עבירו את העליון (supernatant) דרך מסנן ממбраנה של 0.45 µm. הוסיפו למצע הגידול המכיל HBV רקומביננטי נפח שווה של 26% PEG/1.5 M NaCl (פוליאתילנגליקול 60: 130 גרם, NaCl (נתרן כלוריד): 49 גרם, 1 מ"ל של 0.5 M EDTA (Ethylenediamine tetraacetic acid) pH 8.0 ו-5 מ"ל של 1 M HEPES (N-2-hydroxyethylpiperazine-N'-2-ethanesulfonic acid) pH 7.6 ב-50 מ"ל) וערבבו בעדינות. הדגירו למשך לילה בטמפרטורה של 4 °C. סובבו בצנטריפוגה ב-2,30 x g למשך 20 דקות בטמפרטורה של 4 °C. השליכו את העליון והמיסו את המשקע ב-0.5 מ"ל של TNE (10 mM Tris, 50 mM NaCl, 1 mM EDTA). הסירו את השאריות על ידי סבוב בצנטריפוגה ב-2,30 x g למשך 5 דקות. טענו 0.5 מ"ל של TNE המכיל HBV רקומביננטי על גבי 0.8 מ"ל של 20% סוכרוז ב-TNE. סובבו בצנטריפוגה ב-10,0 × g למשך 3 שעות בטמפרטורה של 15 °C. השליכו כמה שיותר מהעליון ושמרו את המשקע. השעיו אותו מחדש ב-1 מ"ל של DMEM נטול סרום עבור כל 40 מ"ל של מצע גידול התחלתי. הדגירו למשך לילה בטמפרטורה של 4 °C. סננו דרך מסנן של 0.45 µm. הכינו אליקוטים (aliquots) של 0.5 מ"ל ואחסנו בטמפרטורה של 80- °C. הערה: אם נצפתה זיהום של חלבון דגל בדגימת הנגיף המקורית, טהרו את הנגיף באמצעות אולטרה-צנטריפוגציה במדרג צפיפות של 5-30% סוכרוז ב-TNE ב-10,0 x g למשך שעתיים, או צנטריפוגה שיווי-צפיפות של CsCl (צסיום כלוריד) מ-1.1-1.6 גרם/מ"ל ב-150,0 x g למשך 50 שעות. נישיצוּג'י, ה', ואחרים. פיתוח מערכת דווח (Reporter System) של נגיף הפטיטיס B לניטור השלבים המוקדמים של מחזור השכפול. J. Vis. Exp. (2017)

סרטון זה מדגים את הייצור והטיהור של חלקי נגיף HBV (Hepatitis B virus) רקומביננטיים, המאפשרים הכנת תכשירי נגיף בטוחים וחסרי יכולת שכפול לצורך חקר אירועי זיהום ראשוניים וליישומים של סריקת תרופות אנטי-ויראליות בסריקה רב-עילית (high-throughput).

פרוטוקול

1. ייצור של HBV (נגיף ההפטיס B) רקומביננטי המקודד לחלבון השגריר

1. הכנת תאי HepG2
   1. הכינו מצע לתרבית תאים (Dulbecco's modified Eagle's medium (DMEM) תוממי 10% fetal bovine serum (FBS), 10 U/ml penicillin, 10 µg/ml streptomycin, ו-10 U/ml של חומצות אמינו לא חיוניות).
   2. זריעו 4 x 10⁶ תאי HepG2 (Human Hepatocellular Carcinoma G2) בצלחת בקוטר 10 ס"מ מצופה קולגן ב-10 ml של מצע תרבית יום לפני הטרנספקציה. דגרו את תאי ה-HepG2 בטמפרטורה של 37 °C באינקובטור לח עם 5% CO₂.
      הערה: כאשר זורעים כ-4 x 10⁶ תאי HepG2 בצלחת בקוטר 10 ס"מ מצופה קולגן ב-10 ml של מצע תרבית, הם יגיעו לרמת התמזגות (confluence) של 70-90% למחרת.
2. טרנספקציה
   1. בצעו טרנספקציה לתאי HepG2 עם 5 µg של pUC1.2HBV delta epsilon15 (פלסמיד רפליקציה של HBV עם מחיקה ברצף האפסילון) ו-5 µg של pUC1.2HBV/NL15 באמצעות ריאגנט לטרנספקציה לפי הוראות היצרן.
   2. למחרת, הסירו את מצע התרבית והוסיפו 10 ml של מצע תרבית טרי.
   3. שבוע לאחר הטרנספקציה, העבירו את מצע התרבית המכיל את ה-HBV הרקומביננטי למבחנה של 50 ml והמשיכו לשלב 1.3. הוסיפו 10 ml של מצע תרבית טרי לצלחת המכילה את התאים שעברו טרנספקציה.
      הערה: ייצור ה-HBV הרקומביננטי נשמר למשך 4 שבועות. ניתן לשמור את מצע התרבית המכיל HBV רקומביננטי בטמפרטורה של 4 °C למשך חודש אחד.
3. טיהור של HBV רקומביננטי
   1. הסירו שיירי תאים ממצע התרבית המכיל את ה-HBV הרקומביננטי על ידי סנטריפוגציה (2,30 x g למשך 5 דקות).
   2. סננו את העילאי דרך מסנן ממברנה של 0.45 µm.
   3. הוסיפו נפח שווה של 26% PEG/1.5 M NaCl (polyethylene glycol 60: 130 g, NaCl (sodium chloride), 49 g, 1 ml של 0.5 M EDTA (Ethylenediamine tetraacetic acid) pH 8.0 ו-5 ml של 1 M HEPES (N-2-hydroxyethylpiperazine-N'-2-ethanesulfonic acid) pH 7.6 ב-50 ml) למצע התרבית המכיל HBV רקומביננטי וערבבו בעדינות. דגרו למשך לילה בטמפרטורה של 4 °C.
   4. סנטריפוגו ב-2,30 x g למשך 20 דקות בטמפרטורה של 4 °C.
   5. השליכו את העילאי והמיסו את המשקע ב-0.5 ml של TNE (10 mM Tris, 50 mM NaCl, 1 mM EDTA).
   6. הסירו את השאריות על ידי סנטריפוגציה ב-2,30 x g למשך 5 דקות.
   7. העמיסו 0.5 ml של TNE המכיל HBV רקומביננטי על גבי 0.8 ml של 20% sucrose ב-TNE.
   8. סנטריפוגו ב-10,0 × g למשך 3 שעות בטמפרטורה של 15 °C.
   9. השליכו כמה שיותר מהעילאי ושמרו את המשקע. השעיקו אותו ב-1 ml של DMEM ללא סרום עבור כל 40 ml של מצע תרבית התחלתי.
   10. דגרו למשך לילה בטמפרטורה של 4 °C.
   11. סננו דרך מסנן של 0.45 µm. הכינו אליקוטים של 0.5 ml ואחסנו בטמפרטורה של -80 °C.
       הערה: אם נצפתה זיהום של חלבון דגל (reporter protein) במדגם הנגיף המקורי, טהרו את הנגיף על ידי אולטרסנטריפוגציה במדרג צפיפות של 5-30% sucrose ב-TNE ב-100,00 x g למשך שעתיים, או סנטריפוגיה שיווי-צפיפות של CsCl (cesium chloride) בטווח של 1.1-1.6 g/ml ב-150,00 x g למשך 50 שעות.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה

שם	חברה	מספר קטלוג	הערות
ריאגנט לבדיקת Nano-Glo Luciferase	Promega	N10
תמיסה מעורבת של פניצילין-סטרפטומיצין	Nacalai tesque	09367-34
DMEM	Thermo Fisher Scientific	11995065
צלחת 10 מ"מ מצופה קולגן	Iwaki	4020-010
חומר טרנספקציה Lipofectamine 30	Thermo Fisher Scientific	L3001
פוליאתילן גליקול (PEG) 60	Sigma-Aldrich	81255
פוליאתילן גליקול (PEG) 80	Sigma-Aldrich	89510
NaCl	Nacalai Tesque	31319-45
תמיסת EDTA בריכוז 0.5 mol/L	Nacalai tesque	06894-14
Tris-HCl	Nacalai tesque	35434-21
Millex-HP, 0.45 μm, פוליאתרהתרסולפון, מסנן	Merck Millipore	SLHP03RS
דימתיל סולפוקסיד (DMSO)	Sigma-Aldrich	D2650
פלטת 96 בארות מצופה קולגן	Corning	NO3585
HepG2-NTCP1-myc-clone2	-	-
pUC1.2HBV delta epsilon	-	-
pUC1.2HBV/NL	-	-