סרטון זה מדגים את השימוש בנגיפי דנסו (densoviruses) רקומביננטיים של יתושים המקודדים ל-microRNA לצורך השתקה של גנים ספציפיים בזחלי יתושים. זחלים נגועים בשלב מוקדם של ההתפתחות מייצרים microRNAs תפקודיים המדכאים את ביטוי הגן מטרה לצורך מחקרים המשכיים.
הרשמה ל-JoVE נדרשת לצפייה בתוכן זה. התחברו או התחילו בגרסת ניסיון בחינם.
מאמר שיטה
השתקת גנים ב larvae של יתושים באמצעות דנסו-וירוס רקומיננטי
88 צפיות
⸱
31 באוגוסט 2026
במאמר זה
תקציר
פרוטוקול
1. טרנסדוקציית יתושים
- שטפו שלש פעמים 10 זחלי Aedes albopictus בשלב השלתקה הראשון (1st instar) באמצעות מים דה-יוניים, ולאחר מכן העבירו את הזחלים לכלי כימיה המכיל 95 mL מים דה-יוניים. הוסיפו 5 mL ממלאי recombinant Aedes aegypti densoviru (rAaeDV) (ריכוז סופי של 1.0 x 1010 copies/mL).
- דגרו למשך 24 h בטמפרטורה של 28 °C, שטפו את הזחלים שלוש פעמים באמצעות מים דה-יוניים, ולאחר מכן העבירו את הזחלים חזרה לצלחות והאכילו אותם באופן סדיר.
- נטרו את רמת הביטוי של הגן המטרה בזחלים באמצעות qPCR או Western blot.
הערה: ניתן להשתמש בשיטת זיהוי אות פלואורסצנציה כדי לבודד את הזחלים המודבקים באופן מדויק יותר. לדוגמה, כדי לזהות אותות פלואורסצנציה מזחלים שהודבקו בנגיס רקומביננטי המבטא DsRed, ניתן להניח את הזחלים על זכוכית כיסוי קעורה ולבחון אותם תחת מיקרוסקופ פלואורסצנציית הפוך בכל 8 h עד ליומיים לאחר ההדבקה. ברגע שזוהו זחלים פלואורסצנטיים, יש להפרידם לכוסות בדיקה פלסטיות בודדות כדי לאפשר תצפית רציפה בהמשך. ניתן לזהות בשיטה זו זחלים שבהם רקמות מרובות הופקעו מההדבקה.
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
חומרים
| שם | חברה | מספר קטלוג | הערות |
|---|---|---|---|
| מכשיר צנטריפוגה | Thermo Scientific | 7504260 | |
| מערכת צנטריפוגה | Beckman Coulter | 36318 | |
| SuperReal PreMix Plus (SYBR Green) | Beijing Tiangen Biotech | FP205 |
