הדמיית קפסידים ויראליים שעברו טיפול בחום באמצעות מיקרוסקופיה אלקטרונית חודרת (TEM)

תקציר

הכנת דגימה ל-TEM השג רשתות עם שכבת תמיכה מפחמן (ניקל) המיועדות ל-TEM. הערה: התייעץ עם מעבדת הליבה לגבי הריאגנטים המומלצים ואופן הטיפול בהם לשימוש במיקרוסקופ של המעבדה. הקפד לאחסן את הרשתות בקופסה המכילה חומר מייבש או בתא ואקום כדי לצמצם את החשיפה ללחות. קרע פיסות נייר סנן בגודל של כ-5 ס"מ x 5 ס"מ. השג צלח Petri מזכוכית ופינצטות הפוכות עם סגירה עצמית המתאימות לשימוש במיקרוסקופיה. גזור פיסה של סרט פאראפין בגודל של כ-2.5 ס"מ x 5 ס"מ. הנח אותה על משטח העבודה. טיפול תרמי של קפסידים של נורו-וירוס GII.4 Sydney השג חלבון קפסיד ראשי (VP1) מופרד של נורו-וירוס אנושי GII.4 Sydney (מספר גישה: JX45908) המורכב לקפסידים. הערה: הקפסידים במחקר זה התקבלו באדיבות של R. Atmar (Baylor College of Medicine, Houston, TX). דל את הקפסידים ב-10 mM 4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazineethanesulfonic acid (HEPES) (pH 7.4) לנפח מקסימלי של 15 µL בתוך מבחנות PCR בודדות עם מכסה. ודא שהמבחנה מכילה לפחות 60 ng של קפסיד. ודא שישנם 60 ng של קפסיד לכל שילוב של טיפול-ליגנד. חמם מראש את התרמוסייקלר לטמפרטורת הטיפול התרמי הרצויה. הערה: בפרוטוקול זה, נבחר טיפול ב-68 °C למשך זמנים שונים (0-25 דקות). חמם מראש תרמוסייקלר נוסף ל-4 °C לצורך קירור מיידי. הוסף את המבחנות עם תמיסת הקפסיד לתרמוסייקלר למשך הזמן הרצוי. מיד לאחר החימום, העבר את המבחנות לתרמוסייקלר שקוורר מראש ל-4 °C למשך 5 דקות. סובב קצרת ב 하며צנטריפוגה כדי שכל הטפטפות יגיעו לתחתית המבחנה. טפטף באמצעות פיפטה את כל טיפת תמיסת הקפסיד המטופלת (~15 µL) על סרט הפאראפין. תפוס את קצה הרשת עם הפינצטות, אפשר להן להיסגר על הקצה כדי להחזיק את הרשת, והנח את הרשת כשצד הפחמן פונה כלפי מטה על גבי טיפת התמיסה המטופלת. הנח לה להתרגול במשך 10 דקות כדי לאפשר לקפסיד להיקשר לרשת. בהתאם לדרגת הניקיון של הכנת הקפסיד, הוסף שטיפות של תמיסת 10 mM HEPES במידת הצורך, בצורה של טפטפות בנפח 10-15 µL המוצבות בשורה לאחר טיפת הקפסיד המטופלת. לאחר 10 דקות, הרם את הרשת עם הטיפה. הנח את הרשת כמעט בניצב לפיסת נייר סנן כדי לספוג את הטיפה. ספוג טיפה של 10-15 µL של באפר HEPES באמצעות הרשת, החזק למשך 30 שניות, ואז ספוג שוב עם פיסת נייר סנן נוספת לצורך שטיפה. הנח טיפה של 15 µL של תמיסת uranyl acetate בריכוז 2% על סרט הפאראפין באזור פנוי. ספוג את טיפת ה-uranyl acetate עם הרשת והחזק למשך 45 שניות. ספוג את ה-uranyl acetate, תוך הקפדה להסיר את מרבית התמיסה. הנח את הרשת כשצד הפחמן פונה כלפי מעלה על פיסת נייר סנן, תוך זהירות שהרשת לא "תידבק" ללחות שעל הפינצטות. הנח את נייר הסנן עם הרשת עליו בתוך צלח Petri פתוח מזכוכית. הערה: אין להשתמש בצלח Petri מפלסטיק, שכן הרשתות יימשכו אליו באופן אלקטרוסטטי ויידבקו לצלח. חזור על הפעולה עבור כל הטיפולים. הנח את חצאי צלח ה-Petri עם הרשתות בדסיקטור למשך לילה כדי שיתייבשו לפני התצפית ב-TEM. התייעץ עם מעבדת המיקרוסקופיה במוסד הרלוונטי לגבי התצפית ברשתות שהוכנו. חלק מהמעבדות מאפשרות למשתמש לעבור הכשרה על תפעול המכשיר במעבדה. פרטים ספציפיים לגבי ההגדרה והתצפית במיקרוסקופ מסוים הם מחוץ להיקף מאמר זה. מור, מ. ד., וכולם. שיטות אלטרנטיביות עבור בדיקה במעבדה (In Vitro) לקביעת השלמות המבנית של קפסידים נגיפיים. .J. Vis. Exp(2017).

סרטון זה מדגים כיצד קפסודים ויראליים מופקים, עוברים טיפול בחום, מוכנים ומצולמים באמצעות מיקרוסקופיה אלקטרונית חודרת (TEM) כדי לחשוף שינויים מבניים ונזקים הנגרמים מחום.

פרוטוקול

1. הכנת דגימות ל-TEM
   1. השיגו רשתות עם ציפוי תמיכה של פחמן (ניקל) המיועדות ל-TEM.
      הערה: התייעצו עם המעבדה המרכזית לגבי הריאגנטים המומלצים ואופן הטיפול בהם לשימוש במיקרוסקופ של המעבדה. הקפידו לאחסן את הרשתות בקופסה המכילה חומר מייבש או בתא ואקום כדי למזער את החשיפה ללחות.
   2. קרעו חתיכות של נייר סינון בגודל של כ-5 ס"מ x 5 ס"מ. השיגו צלחוני פטרי מזכוכית ופינצטות הפוכות עם סגירה עצמית המתאימות לשימוש במיקרוסקופיה.
   3. גזרו חתיכה של סרט פאראפין בגודל של כ-2.5 ס"מ x 5 ס"מ. הניחו אותה על משטח העבודה.
   4. טיפול תרמי של קפסידים של נורו-וירוס GII.4 Sydney
      1. השיגו חלבון קפסיד ראשי (VP1) מופק של נורו-וירוס אנושי מסוג GII.4 Sydney (מספר זיהוי: JX45908) המורכב לקפסידים. 
         הערה: הקפסידים במחקר זה התקבלו באדיבותו של R. Atmar (בית החולים של Baylor College of Medicine, יוסטון, טקסס).
      2. מהלו את הקפסידים ב-10 mM 4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazineethanesulfonic acid (HEPES) (pH 7.4) לנפח מקסימלי של 15 µL במבחנות PCR בודדות עם פק. ודאו שהמבחנה מכילה לפחות 60 ng של קפסיד. ודאו שקיימים 60 ng של קפסיד לכל שילוב של טיפול-ליגנד.
      3. חממו מראש את הטרמוסייקלר לטמפרטורת הטיפול התרמי הרצויה. 
         הערה: בפרוטוקול זה נבחר טיפול ב-68 °C למשכים שונים (0 - 25 דקות).
      4. חממו מראש טרמוסייקלר נוסף ל-4 °C לצורך קירור מיידי. הכניסו את המבחנות עם תמיסת הקפסידים לטרמוסייקלר למשך הזמן הרצוי. לאחר החימום, העבירו באופן מיידי לסייקלר שקוורר מראש ל-4 °C למשך 5 דקות.
      5. סובבו למשך זמן קצר בצנטריפוגה כדי להביא את כל הטיפות לתחתית המבחנה.
      6. העבירו בפיפט את כל טיפת תמיסת הקפסיד המטופלת (~15 µL) על גבי סרט הפאראפין.
   5. אחזו בקצה הרשת בעזרת פינצטה, כך שהפינצטה תיסגר על הקצה ותחזיק את הרשת, והניחו את הרשת כאשר צד הפחמן פונה כלפי מטה על גבי טיפת התמיסה המטופלת. השאירו לה להבקיע למשך 10 דקות כדי לאפשר לקפסיד להיקשר לרשת.
      1. בהתאם לטוהר של תכשיר הקפסידים, הוסיפו שטיפות של תמיסת 10 mM HEPES במידת הצורך, בצורה של טיפות בנפח 10-15 µL המוצבות בקו אחרי טיפת הקפסיד המטופלת.
      2. לאחר 10 דקות, הרימו את הרשת יחד עם הטיפה. הניחו את הרשת כמעט בניצב לחתיכת נייר סינון כדי לספוג את הטיפה. הרימו את טיפת באפר HEPES בנפח 10-15 µL בעזרת הרשת, החזיקו למשך 30 שניות, ולאחר מכן ספגו בעזרת חתיכת נייר סינון נוספת לצורך שטיפה.
   6. הניחו טיפה של 15 µL של תמיסת uranyl acetate בריכוז 2% על סרט הפאראפין באזור פנוי.
      1. הרימו את טיפת ה-uranyl acetate בעזרת הרשת והחזיקו למשך 45 שניות. ספגו את ה-uranyl acetate, תוך הקפדה להסיר את מרבית התמיסה. הניחו את הרשת כאשר צד הפחמן פונה כלפי מעלה על חתיכת נייר סינון, תוך כדי זהירות שהרשת לא "תידבק" ללחות שעל הפינצטה. הניחו את נייר הסינון עם הרשת עליו בתוך צלחון פטרי פתוח מזכוכית.
         הערה: אין להשתמש בצלחוני פטרי מפלסטיק, שכן הרשתות יימשכו אליהם אלקטרוסטטית ויידבקו לצלחון.
   7. חזרו על הפעולות עבור כל הטיפולים. הניחו את חלקי צלחון הפטרי עם הרשתות בתוך דסיקטור למשך הלילה לייבוש לפני התצפית ב-TEM.
   8. התייעצו עם יחידת המיקרוסקופיה במוסד הרלוונטי בנוגע לתצפית על הרשתות שהוכנו. חלק מהמעבדות מאפשרות למשתמש לעבור הכשרה על תפעול המכשיר במעבדה. פרטים ספציפיים לגבי ההגדרה והתצפית במיקרוסקופ מסוים הם מחוץ למסגרת מאמר זה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה

שם	חברה	מספר קטלוג	הערות
הכנת דגימות למיקרוסקופיה אלקטרונית חודרת (TEM)
רשתות למיקרוסקופיה אלקטרונית מניקל עם שכבת תמיכה מפחמן	Ladd Research	1080-10
פינצטות הפוכות עם סגירה עצמית למיקרוסקופיה אלקטרונית	Ted Pella	5372-NM
נייר סינון איכותי	Sigma-Aldrich (Whatman)	WHA100205
צלוחיות פטרי מזכוכית	Sigma-Aldrich	BR45743
תמיסת HEPES מלאי 10 mM (pH 7.2)	N/A	N/A
Uranyl acetate 2%	N/A	N/A