העברת גנים באמצעות בקטריופאג בחיידקי ספירוכטה

תקציר

מקור: Eggers, C. H. מניפולציה גנטית בתיווך פאגים של הספירוכטה הגורמת למחלת הלייים Borrelia burgdorferi. J. Vis. Exp. (2022).

סרטון זה מדגים טרנסדוקציה של ספירוכטות Borrelia שעברו שינוי גנטי באמצעות בקטריופאגים לא-זיהומיים שהשקיעו ב-polyethylene glycol ונושאים פלסמיד לעמידות לקנמיצין. לאחר דגירה עם החיידקים, התרבית נזרעה על מצע המועשר באנטיביוטיקה. רק תאים שקיבלו את הפלסמיד שורדים ויוצרים מושבות. מושבות אלו נבחרות לאחר מכן ומורחבות במצע נוזלי המכיל אנטיביוטיקה כדי לבסס אוכלוסיית חיידקים יציבה הנושאת את הפלסמיד עבור יישומים המשכיים

פרוטוקול

1.בדיקת טרנסדוקציה לאחר שיקוע של בקטריופאג φBB-1 באמצעות PEG (polyethylene glycol)

1. הכינו תרביות של B. burgdorferi שישמשו כמאספים בבדיקות טרנסדוקציה. בהתבסס על הצפיפות שנקבעה, חשבו את נפח תרבית המאסף הדרוש כדי לקבל 15 mL של 1 × 107 spirochetes·mL−1.
2. סבבו את נפח התרבית בצנטריפוגה ב-6,000 x g למשך 10 min. שפכו את העלייה ותלו את המשקע ב-14.5 mL של BSK (Barbour-Stoenner-Kelly) טרי.
3. הוסיפו ≤500 µL של דגימת פאג שהשקיעה ב-PEG לתרבית של שיבט המאסף. ערבבו היטב ודגרו ב-33 °C למשך 72-96 h.
   הערה: כמות הפאג שהופקה במהלך השקיעה ב-PEG יכולה להשתנות, בהתאם למספר גורמים. עם זאת, מתרבית של 15 mL של זן B. burgdorferi CA-11.2A שעבר השראה, 500 µL מכילים בדרך כלל 50-1,000 פאגים חיים. נפחים של התאוששות פאג של ≥500 µL משפיעים לרעה על צמיחת B. burgdorferi, ככל הנראה בשל היחס המוגבר של SM (Suspension Medium) ל-BSK.
4. בצעו ברירה של הטרנסדוקטנטים באמצעות זריעה על מצע מוצק לאחר הערבוב עם פאג שהשקיעה ב-PEG.

2. בחירת התעתיקים (transductants)

הערה: זריעה של טרנסדוקטנטים פוטנציאליים במוצק מבוצעת באמצעות התאמה של הפרוטוקול לשכבה אחת. מושבות של B. burgdorferi גדלות בתוך האגאר, לכן לצורך בחירת טרנסדוקטנטים על ידי זריעה במוצק, יש להוסיף את הדגימות למצע בזמן יציקת הצלחות. טכניקה זו עשויה להיות יעילה גם לבחירת טרנסדוקטנטים, אך טרם נבחנה למטרה זו.

1. קבע את מספר הצלחות הדרושות לבחירת הטרנסדוקטנטים (transductants) בהתבסס על מספר הדגימות מניסויי הטרנסדוקציה והביקורות שיש להעביר לצלחות.
   הערה: בדרך כלל יוצקות שתי צלחות לכל דגימה, אחת השקולה לכ-10% מנפח התרבית ואחת הכוללת את שאר התרבית. בנוסף, יש לצקת צלחות המשמשות כביקורות שליליות כדי לבדוק באופן פרטני שתרבית הפאג' ו/או השבטים ההוריים ששימשו כתורם ו כמקבל אינם גדלים בנוכחות האנטיביוטיקה המשמשת לבחירה. מומלץ להכין חומרי צקיקה למספר של שתי צלחות נוספות לפחות. לדוגמה, אם מספר הדגימות והביקורות שיש להעביר לצלחות הוא שמונה, הכן תערובת צקיקה למספר של 10 צלחות.
2. הכן תמיסות לצקיקה כפי שמתואר להלן.
   הערה: כל צלחת תכיל 30 mL, המורכבים מ-20 mL של 1.5x BSK לצקיקה ומ-10 mL של 2.1% agarose (יחס של 2:1). הדבר יניב צלחת בריכוזים סופיים של 1x BSK ו-0.7% agarose. לדוגמה, עבור 10 צלחות, הכן תערובת צקיקה כוללת של 300 mL, המורכבת מ-200 mL של 1.5x BSK ומ-100 mL של 2.1% agarose.
   1. הכן 1 L של 1.5x BSK תוך שימוש בכמויות של כל רכיב המפורטות עבור 1.5x BSK. אחסן כפי שמתואר עבור 1x BSK.
   2. הכן 2.1% agarose במים ועקר באוטוקלאב. השתמש בתמיסת ה-agarose טרייה או אחסן בטמפרטורת החדר. אם התמיסה מאוחסנת בטמפרטורת החדר, חמם במיקרוגל עם מכסה סגור באופן רופף עד להמסה מלאה לפני הצקיקה.
   3. קבע את נפח האנטיביוטיקה הדרוש להשגת הריכוז המתאים בהתבסס על כל תערובת הצקיקה.
      הערה: אם הנפח הכולל של תמיסת הצקיקה הסופית הוא 300 mL, ערבב 200 mL של 1.5x BSK וכמות מספקת של אנטיביוטיקה כדי להבטיח שלכל 300 mL יהיה את ריכוז האנטיביוטיקה הסופי הנכון. אם לתורם ולמקבל בניסוי הטרנסדוקציה יש גנים שונים לעמידות לאנטיביוטיקה, תערובת הצקיקה צריכה להכיל את שתי האנטיביוטיקות. אם הפאג' שהושקע ב-PEG מהתורם מקודד לסמן עמידות לאנטיביוטיקה ולמקבל אין כזה, תערובת הצקיקה צריכה להכיל רק את האנטיביוטיקה האחת.
3. בהתבסס על מספר הצלחות שיש לצקת, העבר את הכמות המתאימה של 1.5x BSK ואנטיביוטיקה לבקבוק סטרילי הגדול מספיק כדי להכיל את כל תערובת הצקיקה. השג equilibrium במסבך מים ב-56 °C למשך ≥15 min.
4. השג equilibrium ל-agarose מומס מהאוטוקלאב או מהמיקרוגל במסבך מים ב-56 °C למשך ≥15 min.
5. לאחר השגת ה-equilibrium, הוסף את הכמות שנקבעה של 2.1% agarose לבקבוק עם ה-1.5x BSK (עם האנטיביוטיקה) והחזר את תמיסת הצקיקה למסבך מים ב-42 °C למשך 10-15 min.
   הערה: טמפרטורות גבוהות יותר עלולות לפגוע בספירוכטות או להרוג אותן. אם משתמשים באותו מסבך מים כפי שצוין לעיל, קרר את מסבך המים ל-42-45 °C לפני תחילת תזמון ה-equilibrium. אין להניח לתמיסת הצקיקה להגיע ל-equilibrium ב-42 °C למשך יותר מ-20 min, אחרת היא תתחיל להתמצק במהלך יצקת הצלחות.
6. בזמן ה-equilibrium, הכן את דגימות ה-B. burgdorferi שיועברו לצלחות. העבר את הכמות לצקיקה לשפופרת צנטריפוגה קונית סטרילית של 50 mL.
7. אם מצקים כמות קטנה מ-1.5 mL (<5% מנפח הצלחת הסופי של 30 mL), העבר את הדגימה לשפופרת החדשה והוסף את תערובת הצקיקה ישירות לדגימה במהלך הצקיקה.
   1. עבור נפחים גדולים יותר, העבר את נפח התרבית הרצוי לשפופרת החדשה ולאחר מכן צנטריפוג ב-6,000 x g למשך 10 min בטמפרטורת החדר. שפוך את כל הנוזל שמעל המשקע (supernatant) למעט 100-500 µL, והשתמש בשארית כדי לתלה את המשקע באופן מלא לפני הצקיקה.
   2. עבור צלחות ביקורת לאחר תרבית משותפת (co-culture), הוסף ≥107 תאים של שבטי התורם או המקבל לשפופרות צנטריפוגה קוניות סטריליות של 50 mL. אם הנפח עולה על 1.5 mL, צנטריפוג ותלה את המשקע. אם בוצע ניסוי טרנסדוקציה באמצעות פאג' שהושקע ב-PEG, הוסף, בנוסף לשבט המקבל, 100-250 µL מדגימת הפאג' לשפופרת קונית סטרילית של 50 mL לצקיקה.
8. לאחר שתמיסת הצקיקה הגיעה ל-equilibrium ב-42-45 °C למשך 10-15 min, העבר 30 mL מתמיסת הצקיקה לשפופרת עם הדגימה המתאימה; חלק מיד את תערובת הצקיקה והדגימה לתוך צלחת מסומנת. חזור על הפעולה עם פיפטה נקייה עבור כל דגימה המועברת לצלחת.
9. המתן 15-20 min עד שהצלחות יתמצקו, ולאחר מכן הנח אותן באינקובטור ב-33 °C המועשר ב-5% CO₂. אין להפוך את הצלחות למשך 48 h לפחות לאחר הצקיקה.
10. בהתאם לרקע של שבט המקבל, בדוק שהמושבות מופיעות בתוך ה-agarose בצלחות הבחירה לאחר 10-21 ימים של אינקובציה. בחר לפחות 5-10 מושבות הגדלות בצלחת בנוכחות שתי האנטיביוטיקות באמצעות פיפטת בורוסיליקט של 5.75 in סטרילית עם פקק צמר, והעבר אותן ל-1.5 mL של 1x BSK עם האנטיביוטיקה המתאימה.
11. גדל את המושבות המוחדרות ב-33 °C למשך 3-5 ימים או עד שיגיעו לצפיפות של כ-20-40 ספירוכטות לשדה בהגדלה של 200x באמצעות מיקרוסקופ שדה כהה (darkfield microscopy).
    הערה: לאחר סינון, ניתן להקפיא את הספירוכטות לאחסון לטווח ארוך ב-−80 °C על ידי ערבוב נפח שווה של תרבית עם תערובת של 60% glycerol ו-40% 1x BSK שעוקרה על ידי סינון דרך פילטר של 0.22 µm.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה

שם	חברה	מספר קטלוג	הערות
מבחנות צנטריפוגה קוניות 15 mL (פוליפרופילן)	USA Scientific	5618-8271
Mitomycin C	Thermo Fisher Scientific	BP25312	זהירות: חומר מסרטן פוטנציאלי; יש להשתמש אך ורק במנדף כימיים
פיפטות פסטור 5.75" (עם פקק כותנה/זכוכית בורוסיליקט/לא סטריליות)	Thermo Fisher Scientific	13-678-8A	יש להעביר באוטוקלאב לפני השימוש
מבחנות צנטריפוגה קוניות 50 mL (פוליפרופילן)	USA Scientific	1500-1211
אתנול מוחלט
Erythromycin	Research Products International Corp	E57000-25.0
תמיסת ריאגנט Gentamicin	Gibco	15750-060
גלוקוז (Dextrose Anhydrous)	Thermo Fisher Scientific	BP350-500
HEPES	Thermo Fisher Scientific	BP310-500
Kanamycin sulfate	Thermo Fisher Scientific	25389-94-0