החדרת גנים לאורגנואידים של מעי עכבר באמצעות וקטורים לנטיביריים

תקציר

העברה של לנטי-וירוס לאורגנואידים יום 0: יומיים לפני ההעברה, פצלו באר מלאה של אורגנואידים (0.95 סמ"ר) לבאר חדשה, במטרה להשיג כ-50 אורגנואידים קטנים. פצלו את האורגנואידים (איור 1A, B). הוסיפו למצע גידול האורגנואידים 10 µM Chir99021 ו-10 mM nicotinamide כדי להשיג קריפטות היפר-פרוליפרטיביות ציסטיות (איור 1C). הערה: קריפטות ציסטיות יתפתחו בצורה המיטבית כאשר אורגנואידים שפוצלו לאחרונה גדלים בנוכחות Chir99021. יום 2: אספו את האורגנואידים על ידי שאיבה (pipetting) מעלה ומטה של המטריג'ל והמצע, ובכך פצלו את התערובת באמצעות מיקרופיפט p1000. העבירו את התערובת למבחנה של 15 מ"ל. פצלו את התערובת עוד יותר באמצעות פיפט פסטור שפתחו הדיסטלי הוקטן על ידי המסה. סובבו את האורגנואידים בצנטריפוגה להשקה למשך 5 דקות ב-100 x g. הערה: בהתאם לגודל הצנטריפוגה, השתמשו במהירות סבוב שונה. יש למצוא את המהירות המדויקת שבה האורגנואידים המפוצלים נפרדים מהתערובת. הסירו את הנוזל העליון (supernatant) והוסיפו 500 µL של trypsin בריכוז 1x שחומם מראש (דומה ל-trypsin 0.25%). השהו את האורגנואידים ב-trypsin והדגירו למשך 3 דקות באמבט מים של 37 °C. בטלו את פעולת ה-trypsin על ידי הוספת 3.5 מ"ל של מצע גידול לשורות תאים [Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) מועשר ב-10% סרום עגל עוברי (FCS), 1% פניצילין/סטרפטומייצין וגלוטמין]. סובבו בצנטריפוגה למשך 5 דקות ב-500 x g. הסירו את הנוזל העליון כדי להשאיר משקע בכ-20 µL של מצע. העבירו את האורגנואידים בכמות קטנה זו של מצע לבאר בלוח של 48 בארות. הוסיפו לנטי-וירוס בטיטר גבוה במצע העברה (transduction medium), השהו והמשיכו לשלב 3.10 במקרה של יעילות העברה נמוכה. הערה: להעברה יעילה, הוסיפו בדרך כלל אליקוט אחד של 250 µL של לנטי-וירוס בטיטר גבוה לבאר אחת של אורגנואידים. זה מייצג 50% מכל הלנטי-וירוס שנאסף מייצור יחיד. אופציונלי: כדי להגביר את יעילות ההעברה, בצעו ספינוקולציה (spinoculation) על ידי הנחת לוח ה-48 בארות המכיל את האורגנואידים בצנטריפוגה שחוממה מראש ל-32 °C וסבבו ב-600 x g למשך שעה אחת. הכניסו את תערובת האורגנואידים והווירוס לאינקובטור גידול והדגירו למשך שעה אחת ב-37 °C כדי לאפשר את ההעברה. אופציונלי: כדי להגביר עוד יותר את יעילות ההעברה, הדגירו את האורגנואידים למשך 3 שעות נוספות ב-37 °C באינקובטור גידול. הוסיפו 1 מ"ל של מצע גידול אורגנואידים והשהו את תערובת האורגנואידים והווירוס, העבירו למבחנת מיקרוצנטריפוגה וסובבו במיקרוצנטריפוגה למשך 5 דקות ב-850 x g כדי להשקיע את האורגנואידים. הסירו את הנוזל העליון והשהו את המשקע ב-20 µL של Matrigel קר מאוד (ice-cold). כיוון שהחומר מתמצק כאשר הוא מתחמם, השתמשו בקצות פיפט שקוררו על ידי שאיבה מעלה ומטה של PBS קר מאוד מספר פעמים. הניחו את הטיפה במרכז באר בלוח של 48 בארות והדגירו באינקובטור גידול ב-37 °C למשך 15 דקות להתמצקות. לאחר 15 דקות, הוסיפו בזהירות 250 µL של מצע גידול אורגנואידים מועשר ב-10 mM nicotinamide, 10 µM Chir99021 ו-10 µM Y27632. מקטעי אורגנואידים קטנים ומפוצלים יהפכו לאורגנואידים ציסטיים קטנים תוך 24 שעות. יום 5: חדשו את המצע והוסיפו סלקציה של אנטיביוטיקה (עבור puromycin, השתמשו ב-4 µg/mL). יום 7: החליפו את המצע במצע גידול אורגנואידים סטנדרטי, מועשר באנטיביוטיקה לסלקציה. הערה: הניצנינג (Budding) יושלם 2-3 שבועות לאחר הפסקת ה-Chir99021. לאחר הסלקציה, ניתן לגדל את האורגנואידים ללא אנטיביוטיקה לסלקציה. ואן ליד דה יודה, ג'יי. פ', ואחרים. פרוטוקול לטרנסדוקציה לנטיוויראלית ואנליזה המשכית של אורגנואידים של המעי. J. Vis. Exp. (2015)

סרטון זה מתאר טרנסדוקציה לנטיביריאלית של אורגנואידים של מעי עכבר מתוך תרחיף המכיל מבנים דמויי קריפט. באמצעות שימוש במטריצת ממבנה בסיס כפיגום ובתמיה מועשרת בגורמי גדילה, מוחדרים וקטורים לנטיביריאליים כדי לאפשר אינטגרציה גנטית יציבה

פרוטוקול

טרנסדוקציה לנטיביריאלית של אורגנואידים

יום 0:

1. יומיים לפני התעתוק, פצלו באר מלאה של אורגנואידים בשטח של 0.95 cm² לבאר חדשה, במטרה להשיג כ-50 אורגנואידים קטנים. פצלו את האורגנואידים (איור 1A, B).
2. הוסיפו למדיום גידול האורגנואידים 10 µM Chir99021 ו-10 mM nicotinamide כדי להשיג קריפטות ציסטיות היפר-פרוליפרטיביות (איור 1C).
   הערה: קריפטות ציסטיות יתפתחו בצורה הטובה ביותר כאשר אורגנואידים שפוצלו לאחרונה גדלים בנוכחות Chir99021.

יום 2:

3. קצרו את האורגנואידים על ידי שאיבה חוזרת (pipetting up and down) של המטריג'ל והתווך, ובכך פרקו את התערובת באמצעות מיקרופיפט p1000. העבירו את התערובת למבחנה של 15 mL.
4. פרקו את התערובת עוד יותר באמצעות פיפט פסטור שהפתח המרוחק שלו הוקטן על ידי המסה. סובבו את האורגנואידים בצנטריפוגה להשקה למשך 5 min במהירות של 100 x g.
   הערה: בהתאם לגודל הצנטריפוגה, השתמשו במהירות סבב שונה. יש למצוא את המהירות המדויקת שבה האורגנואידים המפורקים נפרדים מהתערובת.
5. הסירו את העלייה (supernatant) והוסיפו 500 µL של 1x trypsin שחומם מראש (דומה ל-0.25% trypsin). השעיקו את האורגנואידים ב-trypsin והדגירו למשך 3 min באמבט מים של 37 °C.
6. בטלו את פעילות ה-trypsin על ידי הוספת 3.5 mL של תוך גידול לקווי תאים [Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) מועשר ב-10% fetal calf serum (FCS), 1% penicillin/streptomycin ו-glutamine]. סובבו בצנטריפוגה למשך 5 min במהירות של 500 x g.
7. הסירו את העלייה כך שתישאר משקה בכ-20 µL של תוך. העבירו את האורגנואידים יחד עם כמות קטנה זו של תוך לבאר בלוח של 48 בארות.
8. הוסיפו לנטיוירוס בטיטר גבוה בתווך טרנסדוקציה, השעיקו והמשיכו לשלב 3.10 במקרה של יעילות טרנסדוקציה נמוכה.
   הערה: לטרנסדוקציה יעילה, הוסיפו בדרך כלל אליקוט אחד של 250 µL של לנטיוירוס בטיטר גבוה לבאר אחת של אורגנואידים. כמות זו מייצגת 50% מכל הלנטיוירוס שנקצר מייצור בודד.
9. אופציונלי: כדי להגביר את יעילות הטרנסדוקציה, בצעו ספינוקולציה (spinoculation) על ידי הנחת לוח ה-48 בארות המכיל את האורגנואידים בצנטריפוגה שחוממה מראש ל-32 °C וסובב במהירות של 600 x g למשך 1 hr.
10. הניחו את תערובת האורגנואידים-וירוס באינקובטור תרביות והדגירו למשך 1 hr ב-37 °C באינקובטור תרביות כדי לאפשר טרנסדוקציה.
11. אופציונלי: כדי להגביר עוד יותר את יעילות הטרנסדוקציה, הדגירו את האורגנואידים למשך 3 hr נוספים ב-37 °C באינקובטור תרביות.
12. הוסיפו 1 mL של תוך גידול לאורגנואידים והשעיקו את תערובת האורגנואידים-וירוס, העבירו למבחנה של מיקרוצנטריפוגה וסובבו במיקרוצנטריפוגה למשך 5 min במהירות של 850 x g להשקת האורגנואידים.
13. הסירו את העלייה והשעיקו את המשקה ב-20 µL של Matrigel קר מאוד (ice-cold). מכיוון שהחומר מתמצק כאשר הוא מתחמם, השתמשו בטיפים של פיפט שקולל על ידי שאיבה חוזרת של PBS קר מאוד מספר פעמים.
14. הניחו את הטיפה במרכז באר בלוח של 48 בארות והדגירו באינקובטור תרביות ב-37 °C למשך 15 min להתמצקות.
15. לאחר 15 min, הוסיפו בזהירות 250 µL של תוך גידול לאורגנואידים מועשר ב-10 mM nicotinamide, 10 µM Chir99021 ו-10 µM Y27632. מקטעים קטנים של אורגנואידים מפורקים יהפכו לאורגנואידים ציסטיים קטנים תוך 24 hr.

יום 5:

16. יש להחליף את המצע ולהוסיף אנטיביוטיקה לבחירה (עבור puromycin, יש להשתמש בריכוז של 4 µg/mL).

יום 7:

1. החליפו את המצע במצע תרבית אורגנוידים סטנדרטי, בתוספת אנטיביוטיקה לסלקציה.
   הערה: תהליך הניבוב (Budding) יושלם כעבור 2-3 שבועות לאחר הפסקת הטיפול ב-Chir99021. לאחר הסלקציה, ניתן לגדל את האורגנוידים ללא אנטיביוטיקה לסלקציה.

תוצאות

איור 1: תרשים של ייצור לנטי-וירוס עבור טרנסדוקציה של אורגנואידים.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה

שם	חברה	מספר קטלוג	הערות
פוליאתילן אימין	Polysciences	23966-2
תווך DMEM	Lonza	BE12-614F
סרום עגל עוברי	Lonza	DE14-801F
פניצילין-סטרפטומייצין	Invitrogen	15140-122
גלוטמין	Invitrogen	25030-024
Matrigel	BD	BD 356231
Advanced DMEM-F12	Gibco	12634-010
N2	Invitrogen	17502-048
B27	Invitrogen	17504-044
N-אצטילציסטאין	Sigma	A9165-1G
Egf של עכבר	Invitrogen	PMG8045
Hepes 1 M	Invitrogen	15630-056
Glutamax 100x	Invitrogen	35050-038
Chir 99021	אקסון	1386
Y27632	Sigma	Y0503-5MG
פוליברן	Sigma	107689
ניקוטינאמיד	Sigma	N0636
טריפסין	Lonza	BE02-007E