זיהוי הפעלת מסלול SMAD באמצעות טרנסדוקציה של אדנו-וירוס כפול

תקציר

טרנסדוקציה של אדנו-וירוס כפול בתאי יחיד חיים זריעה של 1.0 - 1.5 x 105 תאי MDA-MB-231 עם 500 μL של מצע תרבית dulbecco’s modified eagle medium (DMEM) המכיל 5% סרום בקר עוברי (FBS) בכל באער של פלטת 12 באערים (35% התמסכנות תאים, 2 באערים בסך הכל). הדבקת התאים עם 75 μL של וקטור אדנו-וירוס Ad-CMV-GFP (טיטר = 5 x 109 PFU/mL) ו-7.5 μL של וקטור אדנו-וירוס Ad-CAGA12-Td-Tom (טיטר = 5 x 1010 PFU/mL) כדי להשיג ריבוי זיהום (MOI) של 2,500, שיכול להוביל ל-100% חיוביות של זיהום. טיפול בתאים עם או ללא 0.25 μL של transforming growth factor-beta (TGF-β) לבאער (ריכוז במלאי 10 mg/mL, ריכוז סופי של 5 ng/μL) מיד לאחר ההדבקה באדנו-וירוס. הנחת הפלטה באינקובטור בטמפרטורה של 37 °C עם 10% CO2 למשך 24 שעות. דימוג של תאים חיים באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנציה בניגודיות פאזה. עירור של חלבון פלואורסצנציה ירוק (GFP) ב-470 nm וחלבון Td-Tomato ב-554 nm. צ'ן, ה. , ואח'דימיון של תאים חיים של TGF-βמסלול אותיות Smad3 במבחנה ובגוף החי באמצעות מערכת דגמי אדנווירוס. J. Vis. Exp. (2018).

סרטון זה מדגים שיטה לחקר הפעלת מסלול SMAD בתאי סרטן שד באמצעות הדבקה כפולה של אדנו-וירוס. וירוס אחד מעביר גן GFP המבטא ביטוי קבוע, בעוד שהשני נושא רפורטר RFP תחת פרומוטור הרגיש ל-SMAD. בעקבות גירוי של TGF-beta, חלבוני SMAD מופעלים ויוצרים קומפלקס המשרה ביטוי של RFP. זיהוי של אותים כפולים בתאים חיים מאשר את הפעלת המסלול.

פרוטוקול

1. טרנסדוקציה של אדנו-וירוס כפול בתאי יחיד חיים

1. זריעה של 1.0 - 1.5 x 10⁵ תאי MDA-MB-231 ב-500 μL של מצע גידול dulbecco’s modified eagle medium (DMEM) המכיל 5% fetal bovine serum (FBS) בכל באער של פלטה בעלת 12 באערים (35% צפיפות תאים, 2 באערים בסך הכל).
2. הדבקת התאים עם 75 μL של וקטור אדנו-וירוס Ad-CMV-GFP (titer = 5 x 10⁹ PFU/mL) ו-7.5 μL של וקטור אדנו-וירוס Ad-CAGA12-Td-Tom (titer = 5 x 10¹⁰ PFU/mL) כדי להשיג multiplicity of infection (MOI) של 2,500, שיכול להוביל ל-100% חיוביות להדבקה.
3. טיפול בתאים עם או ללא 0.25 μL של transforming growth factor-beta (TGF-β) לבאער (10 mg/mL בתמיסת המקור, 5 ng/μL כריכוז סופי) מיד לאחר ההדבקה באדנו-וירוס.
4. הנחת הפלטה באינקובטור בטמפרטורה של 37 °C עם 10% CO₂ למשך 24 h.
5. דימות של תאים חיים באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנציה בניגודיות פאזה. עירור של green fluorescent protein (GFP) באורך גל של 470 nm ושל חלבון Td-Tomato ב-554 nm.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה

שם	חברה	מספר קטלוג	הערות
DMEM	ThermoFisher	1881024	יש לחמם באמבט מים ב-37 °C לפני השימוש
Foetal Bovine Serum	Scientifix Life	FBS500-S	מנוטרל בחום לפני השימוש
Recombinant Human TGF-β1	PEPROTECH	100-21	יש לחלק למנות ב-DDW כדי להגיע לריכוז סופי של 10 mg/mL
מיקרוסקופיית פלואורסצנציה בניגודיות פאזה	OLYMPUS	IX50
MDA-MB-231	ATCC	CRM-HTB-26
תמיסה			הרכב
FBS-DMEM			5% FBS מנוטרל בחום; 10 μg/mL penicillin; 100 μg/mL streptomycin