דימוי פלואורסצנציה מרובה (Multiplexed) של חומצות גרעין וחלבונים ויראליים בלימפוציטים אנושיים מזוהמים

תקציר

1. צביעה אימונוהיסטוכימית של חלבונים: לסימון חלבון או חלבונים רצויים. שפוך את ה-PBS (סליין עם בופר פוספט) והוסף למסך הזכוכית 200 µL של בופר חסימה (1% משקל/נפח BSA (אלבומין מסרום בקר), 10% נפח/נפח FBS (סרום עגל עוברי) ב-PBS עם 0.1% נפח/נפח Tween-20 (PBST)). הדגר למשך שעה אחת בטמפרטורת החדר (RT). שפוך את בופר החסימה ומרח 200 µL של נוגדן ראשוני מהול ב-PBST + 1% משקל/נפח BSA. הדגר למשך שעה אחת בטמפרטורת החדר. שטוף את הפיתה פעמיים ב-PBST למשך 10 דקות בטמפרטורת החדר תוך써 ניעור. מרח נוגדן משני לפי הבחירה למשך שעה אחת בטמפרטורת החדר ב-PBST + 1% משקל/נפח BSA. שטוף את הפיתה ב-PBST למשך 10 דקות בטמפרטורת החדר תוך ניעור. 2. צביעה גרעינית: צביעת נגד של הגרעינים לאחר הצביעה האימונוהיסטוכימית. שפוך את ה-PBST ומרח DAPI (4',6-diamidino-2-phenylindole) או צבע גרעיני לפי הבחירה למשך דקה אחת בטמפרטורת החדר. שטוף את הפיתה פעמיים ב-PBS למשך 10 דקות בטמפרטורת החדר תוך ניעור. Shah, R., ואחריםדימוי פלואורסצנציה רב-ערוצי ברמה התאית להדמיית חומצות גרעין וחלבונים נגיפיים ולניטור זיהומים של HIV, HTLV, HBV, HCV, נגיף זיקה ושפעת. J. Vis. Exp. (2020)

סרטון זה מדגים ויזואליזציה סימולטנית של DNA, RNA וחלבון הקפסיד של HIV-1 בלימפוציטים אנושיים נגועים באמצעות היברידיזציה של DNA מסועף ואימונופלורסצנציה, מה שמאפשר ניתוח מפורט של שלבי השכפול הוויראלי בתוך תאים בודדים.

פרוטוקול

1. צביעה אימונוהיסטוכימית של חלבונים: לסמימן של חלבון או חלבונים רצויים

1. שפכו את ה-PBS (phosphate-buffered saline) והוסיפו לכיסוי הזכוכית 200 µL של תמיסת חסימה (1% w/v BSA (bovine serum albumin), 10% v/v FBS (fetal bovine serum) ב-PBS עם 0.1% v/v Tween-20 (PBST). דגרו במשך 1 h ב-RT (room temperature).
2. שפכו את תמיסת החסימה והוסיפו 200 µL של נוגדן ראשוני המדולל ב-PBST + 1% w/v BSA. דגרו במשך 1 h ב-RT.
3. שטפו את הפיתח פעמיים עם PBST למשך 10 min ב-RT תוך써ניעור.
4. הוסיפו נוגדן משני לפי הבחירה למשך 1 h ב-RT ב-PBST + 1% w/v BSA.
5. שטפו את הפיתח עם PBST למשך 10 min ב-RT תוך ניעור.

2. צביעה גרעינית: צביעת נגד של הגרעינים לאחר צביעה אימונוהיסטוכימית

1. שפוך את ה-PBST והוסף DAPI (4',6-diamidino-2-phenylindole) או צבע גרעין לבחירתך למשך 1 min ב-RT.
2. שטוף את הפסייד פעמיים עם PBS למשך 10 min ב-RT תוך כדי ניעור.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה

שם	חברה	מספר קטלוג	הערות
Anti-HCV NS5a antibody	Abcam	ab13833	מונוקלונלי לעכבר; עובד עם גנוטיפים 1a, 1b, 3 ו-4 של HCV
Anti-HIV-1 p24 monoclonal antibody	NIH AIDS Reagent Program	3537
Anti-Mov10 antibody	Abcam	ab80613	פוליקלונלי לארנב
Bovine serum albumin			ריאגנט חסימה לצביעה אימונוהיסטוכימית
Cell media with supplements			מדיום המתאים למודל התאים
Coverslips
DAPI	ACD Bio		צביעה גרעינית (ערכת RNAscope מבית ACD Bio)
Dulbecco's phosphate buffered saline (1X PBS)	Gibco	14190250	ללא סידן ומגנזיום
Fetal bovine serum (FBS)			יש להשתמש ב-FBS ספציפי בהתאם לסרום שבו הופק הנוגדן המשני (למשל FBS מעז)
Fisherbrand colorfrost plus microscope slides	Fisher Scientific	12-550-17/18/19	מנוקה מראש
Slides
Tween-20			עבור באפר היברידיזציה של DNA ו-PBS-T