טיהור של אינטסומים של Prototype Foamy Virus באמצעות כרומטוגרפיית הדירה של גדלים (SEC)

תקציר

1. המסה של האינטסומה (Intasome Solubilization) הכינו שני טיפים של פיפט בעלי פיה רחבה על ידי הסרת 2-4 מ"מ מקצה של טיפ בנפח 20 µL באמצעות תער או להב סכיפה חדשים על משטח נקי. הערה: הטיפים ישמשו בשלבים 1.3 ו-1.5. הוציאו את צינור הדיאליזה מתוך תמיסת הדיאליזה. כדי למנוע דילול של דגימת האינטסומה עם תמיסת דיאליזה שעלולה להישאר בקצה הצינור ליד התפסן, השתמשו במיקרופיפט עם טיפ קטן כדי להסיר שאריות של תמיסת דיאליזה. הסירו את התפסן מקצה אחד של צינור הדיאליזה. השתמשו בטיפ פיפט בעל פיה רחבה משלב 1.1 כדי להעביר את הדגימה, כולל המשקע שבתוך צינור הדיאליזה, למבחנה בנפח 1.5 מ"ל על קרח. הערה: הנפח הכולל של החומר שהוחזר הוא בדרך כלל כ-140 µL. הדגימה עם המשקע נמצאת בריכוז של 20 mM NaCl; הגבירו את ריכוז המלח לריכוז סופי של 320 mM NaCl על ידי הוספת הנפח המתאים של תמיססת מקור של 5 M NaCl. לדוגמה, עבור דגימה של 150 µL, הוסיפו 3.9 µL של 5 M NaCl ו-1.1 µL של ddH2O לנפח סופי של 15 µL. העבירו את דלי הקרח עם הדגימה לחדר קירור בטמפרטורה של 4 ˚C. השתמשו בטיפ פיפט בעל פיה רחבה משלב 1.1 כדי לסuspended ולהמיס את המשקע באמצעות פיפטינג. חזרו על הפעולה כל 20 דקות למשך שעה אחת לפחות. שימו לב שרוב המשקע אמור להימס בתמיסה. הערה: ניתן להפסיק את הפיפטינג להמסת המשקע כאשר ניכר שהמשקע אינו פוחת באופן מורגש בין נקודות הזמן. כאשר ה-DNA הנגיפי (vDNA) אינו מסומן או מסומן פנימית, המשקע פוחת בכ-90% על בסיס בדיקה ויזואלית. במקרה של vDNA המסומן בקצה ב-Cy5, המשקע פוחת רק בכ-20%; רוב המשקע עם vDNA המסומן בקצה בפלואורופור לא ימוס. כמות המשקע המומסת ביעילות היא משתנה ויש לקבוע אותה באופן אמפירי. 2. טיהור האינטסומה (Intasome Purification) הכינו 250 מ"ל של תמיסת הרצה לכרומטוגרפיית הפרדה לפי גודל (SEC) (20 mM Bis-tris propane, pH 7.5, 320 mM NaCl, 10% גליצרין). סננו את התמיסה באמצעות יחידת סינון של 0.2 µm ואחסנו בטמפרטורה של 4 ˚C. הערה: כל שלבי הטיהור מבוצעים בחדר קירור בטמפרטורה של 4 ˚C. השילו עמודת SEC של אגרוז מוצלב (קוטר = 10 מ"מ; אורך = 30 מ"מ; נפח המיטה = 24 מ"ל; נפח הדגימה = 25-50 µL; לחץ מקסימלי = 1.5 MPa; גבול הפרדה = 4 x 10^7 Da; מפרידה משקלים מולקולריים בין 5 ל-5,0 kDa, ראו את טבלת החומרים) עם תמיסת הרצה של SEC בקצב זרימה של 0.4 מ"ל/דקה. הערה: ניתן להתאים טיהור זה לעמודות הפרדה לפי גודל שונות, אם הן מסוגלות להפריד ביעילות בין 300 kDa ל-4 kDa, כגון Superose 12 10/30 GL או Superose 6 Increase. ל-Superose 12 10/30 GL יש רזולוציה נמוכה יותר, מה שמוביל ליותר חפיפה בין הפסגות. לעומת זאת, ל-Superose 6 Increase יש רזולוציה גבוהה יותר והיא מציעה הפרדה טובה יותר. סובבו את דגימת האינטסומה במיקרו-צנטריפוגה ב-14,0 x g למשך 10 דקות בטמפרטורה של 4 ˚C כדי לשקע שאריות משקע. הסירו בזהירות את הנוזל העליון (supernatant). העמיסו את הנוזל העליון ללולאת הזרקה של 20 µL (צינור שיכול להכיל כ-200 µL). העבירו את הדגימה לעמודת ה-SEC. הערה: נפחי העמסה קטנים יותר מאפשרים רזולוציה גבוהה יותר ב-SEC. בצעו אלוציה עם 25 מ"ל תמיסת הרצה של SEC ואספו 95 פראקציות של 270 µL. שימו לב שהכרומטוגרמה של ה-SEC מציגה שלושה פסגות של A280/A260 (איור 1). הערה: הראשונה צריכה להיות אגרגט (אלוציה של כ-9.0-1.5 מ"ל), אחריה פסגת האינטסומה של טטראמר PFV (אלוציה של כ-12.0-14.75 מ"ל) ופסגת מונומר PFV IN עם vDNA חופשי (כ-15.0-18.0 מ"ל). מאקלר, ר. מ., ואחריםהרכבה וטיהור של אינטסומים של Prototype Foamy Virus. J. Vis. Exp. (2018)

סרטון זה מדגים את טהרתו של אינטסומים (intasomes) של נגיף קצפי פרוטוטיפי (PFV) מתליה של חלבון-DNA מעורב באמצעות מיצוי מלח וכרומטוגרפיית הדירה של גודל (size exclusion chromatography), המניבה קומפלקסים פעילים לניתוחים המשכיים.

פרוטוקול

1. המסה של האינטסום (Intasome Solubilization)

1. הכינו שני קצות פ pipette בעלי פתח רחב (wide bore) על ידי הסרת 2-4 mm מקצה של טיפ בנפח 20 µL באמצעות תער חדש או להב סקלפל על משטח נקי.
   הערה: הטיפים ישמשו בשלבים 1.3 ו-1.5.
2. הוציאו את צינור הדיאליזה מתמיס הדיאליזה. כדי למנוע דילול של דגימת האינטסומה (intasome) על ידי תמיסת דיאליזה שעלולה להישאר בקצה הצינור ליד התפס, השתמשו במיקרופיפט עם טיפ קטן כדי להסיר כל עודף של תמיסת דיאליזה. הסירו את התפס מקצה אחד של צינור הדיאליזה.
3. השתמשו בטיפ pipette בעל פתח רחב משלב 1.1 כדי להעביר את הדגימה, כולל המשקע שבתוך צינור הדיאליזה, למבחנה בנפח 1.5-mL על קרח. 
   הערה: הנפח הכולל של החומר שחולץ הוא בדרך כלל ~140 µL.
4. הדגימה עם המשקע היא בריכוז 20 mM NaCl; הגבירו את ריכוז המלח לריכוז סופי של 320 mM NaCl על ידי הוספה של הנפח המתאים מתמיסת סטוק של 5 M NaCl. לדוגמה, עבור דגימה של 150 µL, הוסיפו 3.9 µL של 5 M NaCl ו-1.1 µL של ddH₂O לנפח סופי של 15 µL. העבירו את דלי הקרח עם הדגימה לחדר קרר בטמפרטורה של 4 ˚C.
5. השתמשו בטיפ pipette בעל פתח רחב משלב 1.1 כדי לשחזר ולהמיס את המשקע באמצעות פיפטור. חזרו על הפעולה כל 20 דקות למשך שעה אחת לפחות. שימו לב שרוב המשקע אמור להימס בתמיסה.
   הערה: ניתן להפסיק את הפיפטור לשחזור המשקע כאשר ניכר שהמשקע אינו פוחת באופן משמעותי בין נקודות הזמן. כאשר ה-viralDNA (vDNA) אינו מסומן או מסומן פנימית, המשקע פוחת בכ-90% על סמך בדיקה חזותית. במקרה של vDNA עם סימון קצה של Cy5, המשקע פוחת רק בכ-20%; רוב המשקע עם vDNA המסומן בקצה בفلואורופור לא ימיס. כמות המשקע המומסת ביעילות היא משתנה ויש לקבוע אותה באופן אמפירי.

2. ניקוי אינטסום (Intasome Purification)

1. הכינו 250 mL של בופר הרצה לכרומטוגרפיית הֶסְגֵר (SEC) (20 mM Bis-tris propane, pH 7.5, 320 mM NaCl, 10% glycerol). סננו את הבופר באופן סטרילי באמצעות יחידת סינון של 0.2-µm ואחסנו בטמפרטורה של 4 ˚C.
   הערה: כל שלבי הטיהור מבוצעים בחדר קירור בטמפרטורה של 4 ˚C.
2. בצעו שיווי משקל לעמודת SEC של agarose קשורה (קוטר = 10 mm; אורך = 30 mm; נפח המצע = 24 mL; נפח דגימה = 25 - 50 µL; לחץ מקסימלי = 1.5 MPa; גבול החרגה = 4 x 10⁷ Da; מפרידה משקולות מולקולריות בין 5 ל-5,0 kDa, ראו את טבלת החומרים) באמצעות בופר הרצה ל-SEC בקצב זרימה של 0.4 mL/min.
   הערה: ניתן להתאים את התהליך הזה לעמודי הֶסְגֵר שונים אם הם מסוגלים להפריד ביעילות בין 30 kDa ל-44 kDa, כגון Superose 12 10/30 GL או Superose 6 Increase. ל-Superose 12 10/30 GL רזולוציה נמוכה יותר, מה שמוביל לחפיפה רבה יותר בין הפסגות. לעומת זאת, ל-Superose 6 Increase רזולוציה גבוהה יותר והוא מציע הפרדה טובה יותר.
3. סנטריפוגו את דגימת האינטסום במיקרופוגה ב-14,00 x g למשך 10 min בטמפרטורה של 4 ˚C כדי לשקע כל משקב שנותר. הסירו בזהירות את העלייה (supernatant). העמיסו את העלייה ללולאת הזרקה של 20 µL (צינור שיכול להכיל ~20 μL). יישמו את הדגימה על עמודת ה-SEC.
   הערה: נפחי העמסה קטנים יותר מאפשרים רזולוציה גבוהה יותר ב-SEC.
4. בצעו אלוציה באמצעות 25 mL של בופר הרצה ל-SEC ואספו 95 פראקציות של 270 µL. שימו לב כי כרומטוגרמת ה-SEC מציגה שלושה פסגות A₂₈₀/A₂₆₀ (איור 1).
   הערה: הראשונה צריכה להיות אגרגט (~9.0 - 11.5 mL אלוציה), ולאחריה פסגת האינטסום של טטראמר PFV (~12.0 - 14.75 mL אלוציה) ופסגת מונומר PFV IN עם vDNA חופשי (~15.0 - 18.0 mL).

תוצאות

איור 1: כרומטוגרם של הפרדה לפי גודל (SEC). מקבץ אינטסום (intasome) של PFV הופרד באמצעות עמודת SEC של אגרוז. עמודה זו מאפשרת הפרדה של המקבץ (1), אינטסום PFV המורכב מטטramer של PFV IN ושני vDNA (2), ו-PFV IN מונומרי ו-vDNA (3). דוגמה זו כללה vDNA עם סימון פלואורופור Cy5 פנימי שזוה באמצעות עירור של 650 ננומטר. ציר ה-y מציין צפיפות אופטית (OD) ביחידות מילי-בליעה (mAU).

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה

שם	חברה	מספר קטלוג	הערות
אוליגומרים של DNA	IDT	לא רלוונטי	אוליגנוקלאידי DNA בהזמנה אישית
NaCl	P212121	RP-S23020
ביס-טריס פרופאן,>=9.0% (תיסתור)	Sigma-Aldrich	B6755-50G
גליצרין	Thermo Fisher Scientific	G37-20
טיפים לטעינת ג'ל, 1- 200 μL	Corning	CLS4853-400EA
להב תער; בעל דופן אחת; 10 ליחידה; מארז של 10	Fisher Scientific	12-640
תפסים לשרוול דיאליזה	Spectrum Labs	132734
צינור דיאליזה 10 מ"מ, 6-8 kDa	ספקטרום מדיקל (Spectrum Medical)	132645
Superose 6 10/30 GL	GE Healthcare Life Sciences	17517201