השגת RNA ויראלי לצורך אנליזת תגובת שרשרת פולימראז כמותית בזמן אמת (qPCR)

תקציר

עיבוד דגימות נגיף עבור RT-qPCR (תגובת שרשרת פולימראז כמותית בזמן אמת) הערה: יש לבצע את שלבים 1.1–1.3 בתוך קבינה לבטיחות ביולוגית. בפרט, טיפול בתעליל התרבית המכיל נגיף זיהומי חייב להתבצע בסביבה ברמת בטיחות ביולוגית 2 (או גבוהה יותר). 1. ערבב 199 μL של בופר עיבוד ו-1 μL של proteinase K נקי מנוקלאזים. 2. בצע דילול סדרתי של RNA (חומצה ריבנוקלאית) מסוג DENV (נגיף הדנגי) 3’UTR (אזור לא מתורגם) ביחס של 1:10 כדי לקבל סטנדרט RNA של 5 x 10⁹ עד 5 x 10³ עותקים/μL, תוך שימוש בתווך תרבית תאים (למשל, DMEM (תווך eagle משונה של Dulbecco) מועשר ב-10% סרום עגל עוברי ואנטיביוטיקה [DMEM/10% fetal bovine serum]) המכיל 40 יחידות/mL של מעכב RNase. 3. ערבב 5 μL של תעליל התרבית של תאים נגועי DENV ושל סטנדרט RNA של DENV 3’UTR עם 5 μL של תמיסת בופר עיבוד/proteinase K, באמצעות רצועות PCR (תגובת שרשרת פולימראז) של 8 מבחנות או פלטת PCR של 96 בארות. כביקורת ללא תבנית (NTC), ערבב 5 μL של תווך תרבית תאים (כלומר, ללא נגיף) עם 5 μL של תמיסת בופר עיבוד/proteinase K. 4. לאחר סבב צנטריפוגה קצר, הדגר את הדגימות בטרמוסייקלר בתנאים הבאים: מחזור אחד (של 25 °C למשך 10 דקות ו-75 °C למשך 5 דקות). הערה: ניתן לשמור דגימות מעובדות ב-4 °C אם ניתוח ה-real-time PCR מבוצע באותו היום. לאחסון לטווח ארוך, יש לשמור את הדגימות ב-80 °C-. סוזוקי, Y., וכס.מדידת RNA של נגיף הדנגי בתעלומה של תרבית תאים מזוהמים באמצעות תגובת שרשרת פולימראז כמותית בזמן אמת (Real-time Quantitative Polymerase Chain Reaction). J. Vis. Exp. (2018).

סרטון זה מדגים את ההליך להכנת דגימות נגיפיות לניתוח PCR (Polymerase chain reaction) כמותי. דגימות נגיפיות ותקני RNA מדללים בסדרה, מטופלים בבופר proteinase K ומודג rosin בטמפרטורות מבוקרות לשחרור ה-RNA. ה-RNA המעובד מיוצב לאחר מכן ונשמר לצורך כימות רמות ה-RNA הנגיפי.

פרוטוקול

1. עיבוד דגימות נגיף עבור RT-qPCR (תגובת שרשרת פולימראז כמותית בזמן אמת)

הערה: יש לבצע את שלבים 1.1–1.3 בתוך מcomme ביולוגית. בפרט, טיפול בת上-סופרנטנט של תרבית המכיל נגיף זיהומי חייב להתבצע בסביבת רמת ביו-בטיחות 2 (או גבוהה יותר).

1. ערבבו 199 μL של תמיסת עיבוד (processing buffer) ו-1 μL של proteinase K נטול נוקלאז.
2. בצעו דילול סדרתי ביחס של 1:10 ל-RNA (חומצה ריבנוקלאית) מסונתז של DENV (נגיף הדנגי) באזור ה-3’UTR (אזור לא מתורגם), כדי לקבל סטנדרט RNA של 5 x 10⁹ עד 5 x 10³ עותקים/μL, תוך שימוש במצע גידול תאים (למשל, DMEM (מצע Eagle משופר של Dulbecco) בתוספת 10% סרום עוברי בקר ואנטיביוטיקה [DMEM/10% fetal bovine serum]) המכיל 40 units/mL של מעכב RNase.
3. ערבבו 5 μL של עליון התרבית (culture supernatant) של תאים נגועים ב-DENV וסטנדרט RNA של DENV 3’UTR עם 5 μL של תמיסת עיבוד/proteinase K, באמצעות רצועות PCR (תגובת שרשרת פולימראז) של 8 מבחנות או פלטת PCR בעלת 96 בארות. כביקורת ללא תבנית (NTC), ערבבו 5 μL של מצע גידול תאים (כלומר, ללא נגיף) עם 5 μL של תמיסת עיבוד/proteinase K.
4. לאחר סבב צנטריפוגה קצר, דגרו את הדגימות בטרמוסייקלר (thermocycler) בתנאים הבאים: מחזור אחד (של 25 °C למשך 10 min ו-75 °C למשך 5 min).
הערה: ניתן לשמור דגימות מעובדות בטמפרטורה של 4 °C אם ניתוח ה-real-time PCR מבוצע באותו היום. לאחסון לטווח ארוך, יש לשמור את הדגימות בטמפרטורה של -80 °C.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה

שם	חברה	מספר קטלוג	הערות
SimpliAmp Thermal Cycler	Thermo Fisher Scientific	A24811	ניתן להשתמש במכשיר תרמוסייקלר דומה, אך יש לבצע אופטימיזציה לתנאי מחזורי ה-PCR.
Recombinant RNase Inhibitor	Takara Bio. Inc	2313A	40 units/μL
RNeasy Mini Kit	Qiagen	74104	ניתן להשתמש בערכה דומה לטיהור RNA.
Proteinase K	Nacalai Tesque	15679-06	>600 units/mL. ניתן להשתמש בריאגנט דומה.
MicroAmp Fast Optical 96-Well Reaction Plate, 0.1 mL	Thermo Fisher Scientific	4346907	ניתן להשתמש בפלטה או במבחנה דומה בהתאם למכשיר ה-real-time PCR, אך יש לבצע אופטימיזציה לתנאי מחזורי ה-PCR.