קציר חלקיקי נגיף הפטיס E מתאי סרטן כבד אנושיים

תקציר

מקור: Meister, T. L., ושותפיהם מודל תרבית תאים להפקת מאגרי נגיף ההפטיטיס E בריכוז גבוה. J. Vis. Exp. (2020).

סרטון זה מדגים את תהליך בידוד החלקיקים של נגיף ההפטיס E (HEV) מתאי קרצינומה של תאי כבד אנושיים שעברו טרנספקציה. חלקיקים ויראליים חוץ-תאיים נאספים מנוזלים עליונים מסוננים, בעוד שחלקיקים תוך-תאיים משוחררים על ידי חשיפת התאים למספרי מחזורי הקפאה-הפשרה חוזרים. הליזט עובר צנטריפוגציה, והנוזל העליון המכיל חלקי HEV מחולק למנות ונשמר בטמפרטורה נמוכה במיוחד לשימוש עתידי

פרוטוקול

1. הכנת תאי HepG2 לייצור HEV המופק מתרבית תאים (HEVcc)
הערה: כדי למנוע זיהום, הכנת התאים, האלקטרופורציה, ההדבקה, האיסוף וקיבוע התאים בוצעו בתנאים סטריליים במעבדה ברמת בטיחות ביולוגית 2 (biosafety level 2). שלבי דגירה ב-37 °C הכוללים תאים בוצעו באינקובטור עם 5% CO₂.

1. להכנת תאי HepG2 לייצור HEVcc (איור 1), זרעו תאים במצע Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) מלא (ראו טבלה 1) אל תוך צלחת תרבית ขนาด 15 ס"מ מצופה קולגן (ראו טבלה 1, סננו תערובת סטרילית של phosphate-buffered saline (PBS) וחומצה אצטית דרך רשת של 0.2 µm לפני הוספת הקולגן). דגרו בטמפרטורה של 37 °C עד שהתאים יגיעו ל-90% התמזגות (confluency).
   הערה: כל צלחת של 15 ס"מ המכילה תאים ב-90% התמזגות תייצר מספיק תאים לעד 4 אלקטרופורציות.
2. הסירו בעדינות את המצע מהצלחת ושטפו את התאים פעם אחת עם 10 mL של 1x PBS. בצעו טריפסינזציה לתאים על ידי הוספת 3 mL של 0.05% trypsin-EDTA על התאים ודגרו ב-37 °C עד שהתאים יסתלקו לחלוטין. השעיו את התאים שוב ב-10 mL מצע DMEM מלא והעבירו את תרחיף התאים למבחנה של 50 mL. קבעו את מספר התאים הכולל.
3. מכיוון שכל אלקטרופורציה דורשת 5 x 10⁶ תאים, העבירו את הנפח המתאים למבחנה חדשה של 50 mL ומלאו עד לנפח של לפחות 35 mL עם 1x PBS. סובבו את התאים בצנטריפוגה ב-20 x g למשך 5 דקות והסירו בזהירות את העלייה ללא הפרעה של משקע התאים.
4. שטפו את התאים פעם נוספת עם 35 mL של 1x PBS ב-20 x g למשך 5 דקות. הניחו את התאים על קרח ואל תסירו את ה-1x PBS בשלב זה, כדי לשמור על התאים בתרחיף.

2. אלקטרופורציה של תאי HepG2

1. עבור אלקטרופורציה של תאי HepG2 (איור 2) הכין 400 µL של Cytomix complete לכל אלקטרופורציה על ידי תוספת של 2 mM ATP ו-5 mM Glutathione ל-384 µL של Cytomix (ראה טבלה 1). הכן את התמיסה רגע לפני השימוש והנח אותה ישירות על קרח.
   הערה: ביצוע נכון ומהיר של השלבים הבאים הוא קריטי. לכן, ודא שכל הדברים מוכנים כראוי.
2. הסר בזהירות 1x PBS מבלי להפריע למשקע התאים משלב 4.4. השה 5 x 10⁶ תאים ב-400 µL של Cytomix complete והוסף 5 µg RNA. העבר את התמיסה לקובט של 4 mm והפעל פולס אחד של 975 µF, 270 V למשך 20 ms באמצעות מערכת אלקטרופורציה.
   1. לאחר האלקטרופורציה, העבר את התאים במהירות המרבית באמצעות פיפטת פסטור ל-1 mL של DMEM complete לכל אלקטרופורציה.
      הערה: כדי לוודא שה-RNA עבר טרנספקציה בהצלחה לתאי HepG2, תבוצע בקרת טרנספקציה (TC). שיעורי הטרנספקציה הצפויים נעים בין 40-60% של תאים חיוביים ל-ORF2.
3. העבר 10 mL של תאים שעברו אלקטרופורציה לצלוחית תרבית של 10 cm מצופה בקולגן. הוסף 1.3 x 10⁵ תאים שעברו אלקטרופורציה (30 µL) לבאר אחת של פלטת 24-מיקרוטיטר מצופה בקולגן המכילה זכוכית כיסוי (שישמשו מאוחר יותר כבקרת טרנספקציה). פזר את התאים באופן שווה והדגר ב-37 °C.
   1. לאחר 24 שעות, החלף את המצע בצלוחית ה-10 cm והחלף ב-10 mL של DMEM complete טרי. אין להחליף את המצע של בקרת הטרנספקציה. הדגר למשך 6 ימים נוספים ב-37 °C.

3. קציר של נגיפי HEV ממקור תרבית תאים, תוך-תאיים וחוץ-תאיים (HEVcc)

1. כדי לאסוף HEVcc חוץ-תאי (איור 3), סננו את העל-נוזל שהתקבל מהצלחת ה-10 cm לאחר 6 ימים דרך רשת של 0.45 µm כדי להסיר שאריות תאים. שמרו את ה-HEVcc החוץ-תאי שנאסף בטמפרטורה של 4 °C להדבקה באותו היום; אחרת, שמרו בטמפרטורה של -80 °C.
2. כדי לאסוף HEVcc תוך-תאי (איור 3), שטפו את התאים עם 1x PBS ובצעו טריפסינזציה על ידי הוספת 1.5 mL של 0.05% trypsin-ethylenediamine tetraacetic acid (trypsin-EDTA). הדגירה תתבצע בטמפרטורה של 37 °C עד להסרה מלאה של התאים. הוסיפו 10 mL של complete DMEM, שטפו את הצלחת כדי לשחרר את התאים והעבירו את תרחוף התאים למבחנה של 50 mL. שטפו את התאים פעמיים עם PBS. סבבו בצנטריפוגה ב-20 x g למשך 5 דקות.
   1. שפכו את העל-נוזל ותלו את משקע התאים ב-1.6 mL של complete DMEM לכל אלקטרופורציה. העבירו את תרחוף התאים למבחנת תגובה של 2 mL.
      הערה: אין להשתמש בנפחים גדולים יותר, שכן הדבר יפחית באופן דרמטי את העומס הוויראלי.
   2. הקפיאו (בחנקן נוזלי) והפשיתו את התאים. חזרו על רצף זה 3 פעמים.
      הערה: אין לאחד יותר מאלקטרופורציה אחת (1.6 mL) עבור 3 מחזורי ההקפאה וההפשרה, שכן יעילות הליזיס תיפגע. אין להשתמש במיקסר (vortex) בתרחוף התאים בין המחזורים. ודאו כי הפשרת תרחוף התאים מתבצעת לאט (למשל, בטמפרטורת החדר או על קרח) כדי למקסם את העומס הוויראלי.
   3. סבבו את התאים שעברו ליזיס בצנטריפוגה במהירות גבוהה למשך 10 דקות ב-10,0 x g כדי להפריד את שאריות התאים. העבירו את העל-נוזל למבחנה חדשה. השתמשו בעל-נוזל להדבקה; אחרת, שמרו בטמפרטורה של -80 °C.
   4. במידת הצורך, ניתן לרכז את ה-HEVcc החוץ-תאי והתוך-תאי באמצעות מרכז (concentrator) כדי להגביר את העומסים הוויראליים.

טבלה 1: טבלה של הרכב הבאפרים.

תמיסה לעבודה	ריכוז	נפח
קולגן	40 מ"ל	PBS
	40 µl	חומצה אצטית
	1 מ"ל	תמיסת Collagen R סטרילית 0.4%
Cytomix	120 mM	KCl
	0.15 mM	CaCl₂2
	10 mM	K2HPO4 (pH 7.4)
	25 mM	HEPES
	2 mM	EGTA
DMEM מלא	50 מ"ל	DMEM
	5 מ"ל	פניצילין/סטרפטומייצין (Pen/Strep)
	5 מ"ל	MEM NEAA (10X)
	5 מ"ל	L-גלוטמין
	50 מ"ל	סרום בקר עוברי
MEM מלא	50 מ"ל	MEM
	5 מ"ל	סודיום פירובט
	5 מ"ל	גנטמיצין
	5 מ"ל	MEM NEAA (10X)
	5 מ"ל	L-גלוטמין
	50 מ"ל	IgG ברמה נמוכה במיוחד

תוצאות

איור 1: תרשים של מערך הניסוי להכנת תאי HepG2 לייצור נגיף ההפטיס E המופק מתרבית תאים (HEVcc).

איור 2: תרשים של מערך הניסוי לאלקטרופורציה של תאי HepG2.

איור 3: תרשים של מערך הניסוי לאיסוף HEVcc תוך-וחוץ תאי.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה

שם	חברה	מספר קטלוג	הערות
0.45 µm רשת	Sarstedt	83.1826	איסוף נגיפים חוץ-תאיים
MEM	gibco	31095-029	תרבית תאים
MEM NEAA (10×)	gibco	11140-035	תרבית תאים
טריפסין-EDTA (0.5%)	gibco	15400054	תרבית תאים
IgG ברמה נמוכה מאוד	gibco	192105PJ	תרבית תאים
חומצה אצטית	CarlRoth	6755.1	תמיסת עבודה של קולגן
ATP	Roche	11140965001	טרנסקריפציה במבחנה (In vitro transcription) ואלקטרופורציה
BioRender	BioRender		הפקת איורים
סידן כלורי	רוט	5239.2	Cytomix
תמיסת Collagen R סטרילית 0.4%	Serva	47256.01	תמיסת עבודה של קולגן
DMEM	gibco	41965-039	תרבית תאים
EGTA	רוט׳	3054.3	Cytomix
מערכת אלקטרופורציה GenePulser Xcell	BioRad	1652660	אלקטרפורציה
HEPES	Invitrogen	15630-03	Cytomix
די-קלום מימן פוספט	רוט	P749.1	Cytomix
KCL	רוט׳	6781.3	Cytomix
פוטאסיום די-הידרוגן פוספאט	רוט	3904.2	Cytomix
L-גלוטמין	gibco	25030081	תרבית תאים
L-Glutathione reduced	Sigma-Aldrich	G4251-5G	Cytomix
MEM	gibco	31095-029	תרבית תאים
MEM NEAA (10×)	gibco	11140-035	תרבית תאים
מגנזיום כלוריד	רוט	2189.2	Cytomix
ספקטרופוטומטר UV-Vis למיקרו-נפח NanoDrop One	Thermo Fisher	ND-ONE-W	ריכוז DNA/RNA
PBS	gibco	70011051	תרבית תאים
פניצילין/סטרפטומייצין (Pen/Strep)	Thermo Fisher	15140122	תרבית תאים