טיהור נגיף מנוזל האלנטואיס של ביצי תרנגולת עם עוברים

תקציר

מקור: Yates, J. G. E., ואחרים. ייצור של נגיף מחלת ניוקאסל רקומביננטי בתרC גבוה מנוזל אלנטואיס. .J. Vis. Exp (2022)

הסרטון מדגים את טהרתם וריכוזן של חלקי וירוס מנוזל אלנטואיס מזולל שנאסף מביצי תרנגולת עם עובריים נגועי וירוס. הוא מציג סדרה שלבי סינון והפרדה, הכוללים סינון עומק (depth filtration), סינון זרימה מומסית (tangential flow filtration) ואולטראצנטריפוגה במדרג צפיפות להבדיל וירוסים שלמים. הפракציה העשירה בווירוסים עוברת לאחר מכן דיאליזה להסרת מלחים שאריתיים ומרכיבי מדרג באמצעות דיפוזיה, ולאחריה ריכוז באמצעות תמיסה היפרטונית בתהליך אוסמוזה. התוצאה היא תכשיר וירוס מטוהר בעל תר בטרי (titer) גבוה המתאים לשימוש ניסיוני.

פרוטוקול

1. הגברה של נגיף מחלת ניוקאסל (NDV) באמצעות ביצי תרנגולת עוברות נקיות מפתוגנים מוגדרים

1. החדרה לביצי תרנגולת עם עוברים הנקיות מפתוגנים ספציפיים (SPF)
   הערה: בדרך כלל, נעשה שימוש בשמונה תריסרי ביצי תרנגולת עובריות מסוג SPF כדי להפיק מנה אחת של נגיף מחלת ניוקאסל (NDV) בדרגת in vivo. הזמינו תריסר או שני תריסרים נוספים של ביצים כדי להבטיח פיצוי על נזקים במהלך השילוח, וכן על שונות ביכולת ההישרדות.
   1. לאחר קבלת ביצי תרנגולות עובריות SPF, דגרו אותן במדגרה לביצים ב- 37 °C, 60% לחות למשך 9 ימים. יש לוודא שהאינקובטור מוגדר לערבוב/סיבוב אוטומטי של הביצים בכל שעה.
      הערה: ניתן לאחסן את הביצים ....

תוצאות

איור 1: הדבקה וקציר של NDV מביצי תרנגולת עובריות נקיות מפתוגנים מוגדרים. (A) וסקולטורה דמוית רשת (חצים) צריכה להיות גלויה לאחר 9 ימי דגירה, בנוסף לתנועת העובר. 'X' מסמן את הממשק בין קרומי הכוריואלנטואיס לבין חל האוויר, ושם יש.......

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה

שם	חברה	מספר קטלוג	הערות
מזרק 1 מ"ל עם קצה החלקה (Slip-Tip)	BD	309659
מזרקה עם חיבור Luer-Lok בנפח 10 מ"ל	BD	302995
תמיסת פובידון יוד 10%	לוֹרִיס (LORIS)	109-08
מבחנות קוניות של 15 מ"ל	Thermo-Fisher	14955240
מחט מילוי קהה בגודל 1 1/2 אינץ', 18G	BD	305180
מחט Precision Glide בגודל 18G x 1 1/2 אינץ'	BD	305196
מחט 25 G x 5/8 אינץ'	BD	305122
מזרק Luer-Lok בנפח 5 מ"ל	BD	309646
חומצה אצטית, גלציאלית	Thermo-Fisher	A38-212
אגרוז	Froggabio	A87-50G
Alexa-Fluor 48 Goat-Anti-Mouse	Invitrogen	A101
צנטריפוגה Allegra X-14	Beckman Coulter	B0861
אמוניום פרסולפט	BioRad	161-0700
תמיסת הלבנה (5%)	Thermo-Fisher	36-102-0599
פינצטה רחבה בעלת קצוות ללא שיניים	Thermo-Fisher	09-753-50
ברומופנול בלו (Bromophenol Blue)	Sigma-Aldrich	1405-25G
מחזיק קסטות Centramate	PALL	CM018V
ChemiDoc XRS+	BioRad	1708265
מדגרה לביצים Digital 1502 Sportsman	ברי היל	1502W
D-מניטול	Sigma-Aldrich	M4125-50G
מכשיר לבדיקת ביצים (Egg Candler)	ברי היל	A46
אתנול (70%)	Thermo-Fisher	BP82031GAL
מחברי T עם הברגה פנימית, ניילון, 1/8 אינץ' NPT(F)	Cole-Parmer	06349-50
ערכה לבדיקת לחות	ברי היל	3030
איודיקסנול	Sigma-Aldrich	D156	תמיסה של 60% (משקל/נפח) של iodixanol במים (סטריליים)
L-Lysine Monohydrochloride	Sigma-Aldrich	62929-100G-F
Luer-Lok זכר ונקבה עם הברגת צינור לאומית (NPT) בקוטר 1/8 אינץ'	Cole-Parmer	41507-44
מנוע דיגיטלי Masterflex L/S	Cole-Parmer	RK-0752-20	משאבה פריסטלטית עם תצוגה דיגיטלית
ראש משאבה Masterflex L/S Easy Load עבור Tubing מדויק	Cole-Parmer	RK-07514-10
צינור סיליקון Masterflex (פלטינה) L/S 16	Cole-Parmer	96420-16	סיליקון BioPharm עם פסיקה פלטינית (Platinum-Cured)
קסטת Omega Membrane LV Centramate, 10K	PALL	OS10T02
אולטרסנטריפוגה Optima XE-90	Beckman Coulter	A9471
תמיסת PBS בריכוז 10X	Thermo-Fisher	BP39-20
פוליאתילן גליקול (Poly(Ethylene Glycol)) ממוצע Mn 20,0	Sigma-Aldrich	8130-1KG
קסטת דיאליזה Slide-a-lyzer (בעוצמה גבוהה), 10,00 MWCO 0.5-3 מ"ל	Thermo-Fisher	66380
נתרן הידרוקסיד (גרגירים)	Thermo-Fisher	S318-10
ביצים חופשיות מפתוגנים ספציפיים (SPF)	CFIA	לא רלוונטי	הספק ישתנה בהתאם למיקום
סוכרוז	Thermo-Fisher	S5-3
מסנן עומק Supracap 50	PALL	SC050V10P
מספריים כירורגיים	Thermo-Fisher	08-951-5
רוטור Sw41Ti	Beckman Coulter	331362	בשימוש בשלבים 2.3.1, 2.3.6, 2.3.7 של הפרוטוקול
רוטור SX4750	Beckman Coulter	369702
מתאם SxX4750 למבחנות בעלות תחתית קונית	Beckman Coulter	359472
מבחנות צנטריפוגה Ultraclear בעלות דופן דקה (9/16 אינץ' x 3 1/2 אינץ')	Beckman Coulter	344059
מהבץ בורג לצינור	PALL	88216
מדי לחץ כלליים	Cole-Parmer	68355-06