טיהור נגיף מנוזל האלנטואיס של ביצי תרנגולת עם עוברים

תקציר

מקור: Yates, J. G. E., ואחרים. ייצור של נגיף מחלת ניוקאסל רקומביננטי בתרC גבוה מנוזל אלנטואיס. .J. Vis. Exp (2022)

הסרטון מדגים את טהרתם וריכוזן של חלקי וירוס מנוזל אלנטואיס מזולל שנאסף מביצי תרנגולת עם עובריים נגועי וירוס. הוא מציג סדרה שלבי סינון והפרדה, הכוללים סינון עומק (depth filtration), סינון זרימה מומסית (tangential flow filtration) ואולטראצנטריפוגה במדרג צפיפות להבדיל וירוסים שלמים. הפракציה העשירה בווירוסים עוברת לאחר מכן דיאליזה להסרת מלחים שאריתיים ומרכיבי מדרג באמצעות דיפוזיה, ולאחריה ריכוז באמצעות תמיסה היפרטונית בתהליך אוסמוזה. התוצאה היא תכשיר וירוס מטוהר בעל תר בטרי (titer) גבוה המתאים לשימוש ניסיוני.

פרוטוקול

1. הגברה של נגיף מחלת ניוקאסל (NDV) באמצעות ביצי תרנגולת עוברות נקיות מפתוגנים מוגדרים

1. החדרה לביצי תרנגולת עם עוברים הנקיות מפתוגנים ספציפיים (SPF)
   הערה: בדרך כלל, נעשה שימוש בשמונה תריסרי ביצי תרנגולת עובריות מסוג SPF כדי להפיק מנה אחת של נגיף מחלת ניוקאסל (NDV) בדרגת in vivo. הזמינו תריסר או שני תריסרים נוספים של ביצים כדי להבטיח פיצוי על נזקים במהלך השילוח, וכן על שונות ביכולת ההישרדות.
   1. לאחר קבלת ביצי תרנגולות עובריות SPF, דגרו אותן במדגרה לביצים ב- 37 °C, 60% לחות למשך 9 ימים. יש לוודא שהאינקובטור מוגדר לערבוב/סיבוב אוטומטי של הביצים בכל שעה.
      הערה: ניתן לאחסן את הביצים בטמפרטורת החדר למשך עד 24 שעות או 4 °C עד 72 שעות; עם זאת, הדבר עשוי להפחית את חיוניות העובר.
   2. לאחר 8–1 ימי דגירה (באופן אידיאלי ביום התשיעי), יש לבצע בדיקת תאורה (candling) לביצים כדי לקבוע את חיות העובר. חפשו רשת של כלי דם (איור 1A) ותנועת עובר כאינדיקטורים לעוברים חיוניים. השליכו ביצים שחסרים בהן מאפיינים אלו (איור 1ב).
   3. על הביצים החיוניות, סמנו בעיפרון בסימן 'X' את הממשק שבין שק האוויר לעובר (איור 1A). ודאו שאתר ההזרקה לא יגרום לנקב בכלי הדם. החזירו את הביצים המסומנות למדגרה בזמן שהאינוקולום (titer) מוכן.
   4. חשבו את כמות הנגיף הדרושה להזרקה לכל ביצי העוף המעובדות מסוג SPF. ודאו שכל ביצה מקבלת 10 יחידות יוצרות פlaque (PFU) של נגיף בנפח של 100 µL; לדל את הווירוס בתמיסת סליין עם בופר פוספט (PBS) לריכוז של 1 × 10³ PFU/mL. הכינו 20% נוספים מהאינוקולום כדי לפצות על אי-דיוקים בהחדרת הווירוס.
   5. באמצעות מטלית אנטי-סטטית, נקו את חלקי העליון של הביצים המסומנות באמצעות תמיסת יוד בריכוז של 10% המדוללת ב-70% אתנול. המתינו כ-1–2 דקות עד שהתמיסה תתייבש.
   6. נקב את הקליפה בזהירות באמצעות פינצטה חדה וסטרילית. חטא את הפינצטה באתנול 70% בין ביצה לביצה.
   7. השתמש במזרק של 1 מ"ל ובמחט 25 G, והזרק 100 µL של האינוקולום שהוכן בשלב 1.1.4 אל תוך החל החוריואלנטואי (chorioallantoic cavity)איור 1C). התקרבו עם המחט בזווית של כמעט 90° בזווית כלפי הביצה. הכניסו את המחט רק לחלק העליון של קרומי העוברי-שקיות (chorioallantoic membrane).
   8. לאחר ההזרקה, השתמשו בלק לציפורניים כדי לכסות את נקודת הדקירה והחזירו את הביצים למדגרה. ודאו שהגדרת התנועה (rocking) מופעלת עד 24 שעות לאחר ההזרקה.
   9. בדקו את חיוניות הביצים 24 שעות לאחר ההזרקה. השליכו ביצים מתות שבהן אין כלי דם בממברנה החוריאו-אלנטואית ותנועתו של העובר (איור 1B).
      הערה: ביצים אלו מתו כתוצאה מתהליך ההזרקה ולא בשל NDV.
   10. החזירו את הביצים למדגרית, כאשר הגדרת הנדנדה (rocker) כבויה, כדי למנוע זיהום של הנוזל האלנטואיס (allantoic fluid) בחלבוני ביצה.
   11. בדקו את הביצים בכל 12–24 שעות כפי שמתואר בשלב 1.1.9 כדי לזהות ביצים מתות. העבירו את הביצים שמתו לאחר 24 שעות מההדבקה אל 4°C כדי למזער אוטוליזה. אספו את הנוזל האלנטואי במהלך 2–12 שעות מהקירור.
   12. דגרו את הביצים למשך 72 שעות לפחות.
       הערה: במקרה של הרביה של זן מזוגני (mesogenic) של NDV, זמן הדגירה האופטימלי הוא 60-72 שעות, שכן זמני דגירה ממושכים עלולים לפגוע בתהליך הטיהור בשל ירידה בצלוליות הנוזל האלנטואי. סוגיה זו אינה משמעותית בעת הרביית זנים לנטוגניים (lentogenic) של NDV, מכיוון שהם דורשים זמן רב יותר כדי להביא למות העובר.
   13. לאחר תקופת הדגירה המתאימה, העבירו את הביצים שנותרו ל- 4 °C במשך 2-12 שעות לפני איסוף הנוזל האלנטואי.
2. קצירת נוזל אלנטואיס המכיל NDV
   1. העבירו את הביצים המקוררות אל תא הבטיחות הביולוגית. נקו את חלקי העליון של הביצים באמצעות אתנול 70%.
   2. השתמשו בפינצטה סטרילית ובמספריים כירורגיים כדי לפתוח את הצד האפקלי (הקודקודי) של הביצה, במקום שבו נמצא שקיק האוויר.
   3. הסר את הקליפה כדי לחשוף את קרומי העוברית (ה-chorioallantoic membrane)איור 1D).
   4. נקב בזהירות את הקרום וקלף אותו לאחור כדי לחשוף את חל האלנטואיס (איור 1E). ודאו ששקיק החלמון לא ננקב בטעות, שכן הדבר יספיק את הביצה.
   5. השתמשו בפינצטה קהה כדי לתפוס את העובר ולפתוח את שק העובר.
      הערה: הנוזל שבתוך שק העוברי מכיל גם NDV.
   6. לחץ על העובר בעזרת פינצטה ואסוף את הנוזל האלנטואידי באמצעות פיפטה סרולוגית של 10 מ"ל.
   7. יש לשמור את הנוזל האלנטואיסי על קרח במבחנות קוניות של 15 מ"ל עד לשלב הזילול.
      הערה: אם הנוזל האלאנטואי (allantoic fluid) צהוב, המשמעות היא ששק החלמון נפגע ויש להשליך את הנוזל האלאנטואי.
   8. סבבו בצנטריפוגה את המבחנות הקוניות המכילות את הנוזל האלאנטואי (allantoic fluid) במהירות של 1,50 × גרם למשך 10 דקות ב- 4 °C.
   9. נקודת עצירה: חלק את הנוזל האלנטואי (allantoic fluid) המזוכל למבחנות קוניות של 50 מ"ל ואחסן אותן ב-80 °C לאחסון לטווח ארוך (למשל, שבועות עד חודשים), יש להוסיף לנוזל סוכרוז עד לריכוז סופי של 5%, כדי להגן על הנגיף מההשפעות הקשות של הקפאה והפשרה. לחלופין, לאחסון לטווח קצר (למשל, 1-3 ימים), יש להוסיף לנוזל האלנטואיס סוכרוז (5% סופי) או 3× בופר מניטול-ליזין (ML) (15% מניטול, 3% ליזין) כדי להגיע לריכוז סופי של 1× (5% מניטול, 1% ליזין) לפני אחסון ב- 4 °C.

2. טיהור של NDV מנוזל אלנטואיס

1. סינון עומק (Depth filtration) של נוזל אלנטואיס
   1. יש לאחסן את נוזל האלנטואיס המזוכל בטמפרטורה של -80 °C ולהפשיר אותו ב-4 °C בלילה שלפני הטיהור.
   2. בתוך קבלית בטיחות ביולוגית, יש להכין את הצינורות ואת משאבת הפריסטלטיקה כפי שמוצג ב-איור 2.
   3. אם הדבר טרם בוצע, יש לערב את נוזל האלנטואיס עם באפר ML בריכוז 3× עד לריכוז סופי של 1×.
   4. לפני חיבור מסנן העומק, יש לעקר את הצינורות על ידי העברה של 50 mL של נתרן הידרוקסיד (NaOH) בריכוז 0.5 M דרך המערכת אל כלי פסולת.
   5. יש לשטוף את הצינורות על ידי העברת 10 mL של מים סטריליים בדרגת טוהר מולקולרית דרך המערכת אל כלי הפסולת.
      הערה: מכיוון ש-NaOH יעניב את ה-NDV, חשוב שקווי הצינורות יישטפו כראוי לפני הכנסת נוזל האלנטואיס המכיל את הווירוס.
   6. יש להכין (Prime) את המערכת על ידי העברת 50 mL של PBS דרכה, ולהפסיק את פעולת המשאבה כאשר נותרים כ-5 mL של PBS בצינור.
   7. יש לחבר מסנן עומק עם דירוג שימור של 1-3 µM לצינורות ולהסיר את הפק השני בצד האפיקלי של מסנן העומק כדי לאוורר את המסנן. יש להתחיל להעביר 50 mL נוספים של PBS דרך המערכת.
   8. ברגע ש-PBS מתחיל לזרום דרך פתח האוורור בחלק העליון של המסנן, יש לסגור את הפתח ולהמשיך להזרים PBS דרך הצינורות.
      הערה: בועות אוויר קטנות הן מקובלות, אך נוכחות של כמויות גדולות של אוויר תדרוש אוור מחדש של המסנן כפי שמתואר בשלבים 2.1.7 ו-2.1.8.
   9. יש להפסיק את המשאבה כאשר נותרים כ-5 mL של PBS בצינור.
   10. יש להחליף את כלי הפסולת בכלי איסוף סטרילי חדש ולהתחיל להזרים נוזל אלנטואיס דרך מסנן העומק.
       הערה: הלחץ לא יעלה על 10 psi, שכן הדבר יגרום לשבירה (shearing) של הווירוס. ניתן לשלוט בלחץ על ידי הפחתה או הגברה של קצב הזרימה של המשאבה. אם הלחץ מתחיל לעלות מעל 10 psi ואי אפשר להפחית את קצב הזרימה יותר, יש להשתמש במסנן עומק חדש. במקרה זה, יש לבצע את שלבים 2.1.6-2.1.8 לפני חידוש זרימת נוזל האלנטואיס.
   11. לאחר שכל נוזל האלנטואיס עבר דרך המסנן, יש להזרים 50 mL של באפר ML בריכוז 1× דרך הצינורות כדי למקסם את התשוא של הווירוס.
   12. יש לאסוף את הנוזל עד שהצינורות מתרוקנים. יש לאחסן את הווירוס למשך לילה או עד 36 שעות ב-4 °C.
       הערה: לאחר שבוצע סינון עומק לווירוס, יש להמשיך בתהליך הטיהור תוך 36 שעות מסיום סינון העומק.
   13. יש לנתק את מסנן העומק ולחטא את הצינורות על ידי העברת 10 mL של 0.5 M NaOH עם 40 ppm של הלבנה, שחוממו מראש ל-42 °C, דרך המערכת לפני האחסנה ב-0.5 M NaOH.
2. סינון זרימה מماسית (TFF) לריכוז ה-NDV
   1. יש להרכיב את רכיבי הקסטה כפי שמתואר ב-איור 3A בתוך קבלית בטיחות ביולוגית.
      הערה: יש לשטוף את המניפולטור (manifold) ואת לוח הקצה בדטרגנט ולייבשם לפני השימוש. אטמי הסיליקון הם רב-פעמיים ויש לאחסנם ב-0.5 M NaOH יחד עם הקסטה.
   2. יש להגדיר את מערכת סינון הזרימה הממסית (TFF) (הידועה גם כסינון זרימה צולבת) בתצורה 'פתוחה' (איור 3B).
      1. במידה והקסטה בשימוש בפעם הראשונה, יש להרכיב את קסטת ה-TFF בתצורת אלוציה (Elution) ולשטוף עם 10 mL של מים סטריליים בדרגת טוהר מולקולרית (איור 3C).
      2. כאשר נותרו רק 5 mL של מים במיכל המאגר, יש להשהות את המשאבה ולשנות את הגדרת מערכת ה-TFF לתצורה סגורה (איור 3D).
      3. יש להוסיף למאגר 10 mL של 0.5 M NaOH עם 400 ppm של הלבנה שחוממו מראש ל-42 °C ולהזרים במעגלים דרך המערכת למשך 30-60 דקות.
      4. יש להשהות את הזרימה ולהחזיר את מערכת ה-TFF להגדרת אלוציה, ולחדש את הזרימה כדי לשטוף החוצה את תמיסת הניקוי.
      5. כאשר נותרו כ-5 mL במאגר, יש להשהות את המשאבה ולהוסיף 10 mL של מים סטריליים בדרגת טוהר מולקולרית כדי לשטוף את המערכת.
      6. כאשר נותרו כ-5 mL במאגר, יש להשהות את המשאבה ולהעביר את מערכת ה-TFF לתצורה הפתוחה (איור 3B). יש להמשיך לשלב 2.2.3.
   3. יש לעקר את הקסטה והצינורות על ידי העברת 10 mL של 0.5 M NaOH דרך המערכת באמצעות משאבת הפריסטלטיקה. יש לוודא שהלחץ אינו עולה על 30 psi כדי לשמור על שלמות הקסטה.
   4. יש להשהות את המשאבה כאשר נותרו כ-5 mL של 0.5 M NaOH במאגר.
   5. יש להוסיף למאגר 10 mL של מים סטריליים בדרגת טוהר מולקולרית ולחדש את העברת הנוזל דרך הקסטה. יש לסובב את המאגר כדי לשטוף את כל ה-NaOH מדפנות המאגר כדי למנוע השבקה של הווירוס. יש לחזור על שלב שטיפת המאגר.
   6. כאשר נותרו כ-5 mL של מים סטריליים בדרגת טוהר מולקולרית במאגר, יש להשהות את המשאבה.
   7. יש להוסיף למאגר 10 mL של PBS, תוך סיבוב כדי להבטיח שכל המים הסטריליים בדרגת טוהר מולקולרית נשטפים מהדפנות. יש לחדש את זרימת הנוזל דרך הקסטה.
   8. כאשר נותרו כ-5 mL במאגר, יש להשהות את המשאבה, להוסיף למאגר נוזל אלנטואיס שעבר סינון עומק, ולחדש את זרימת המשאבה.
   9. יש לנטר את מד הלחץ 1 (איור 3B) כדי לוודא שהוא אינו עולה על 10 psi למניעת שבירה של הווירוס. יש להשתמש בשילוב של מהירות משאבת הפריסטלטיקה ושימוש בתפסני C-clamps כדי להגביר את האלוציה לפסולת.
      הערה: שילוב של מהירות משאבת הפריסטלטיקה ותפסני C-clamps יביא לעלייה בלחץ.
   10. כאשר נותרו 50-10 mL של נוזל אלנטואיס במאגר, יש להשהות את המשאבה כדי לבצע החלפת באפר על ידי הוספה של 150-20 mL של באפר ML בריכוז 1×.
   11. יש לחדש את זרימת המשאבה, תוך ניטור חוזר של מד הלחץ 1 (איור 3B) כדי לוודא שהוא אינו עולה על 10 psi.
   12. כאשר נותרו 5-10 mL במאגר, יש להשהות את המשאבה.
   13. בעזרת שני תפסני C-clamps, יש לסגור את שני קווי הפסולת כפי שמוצג ב-איור 3C.
   14. יש לנתק את קו הרטנטט (retentate) המזין את המאגר ולהכניסו לתוך מבחנה קונית של 50 mL (איור 3C).
   15. יש לחדש את זרימת המשאבה, ולהשהותה כאשר נותרים מספר טיפות נוזל במיכל המאגר.
   16. יש להסיר את תפסני ה-C-clamps מקווי הפסולת ולחבר מחדש את קו הזנת הרטנטט למיכל המאגר (איור 3B).
   17. יש להוסיף 20-25 mL של באפר ML בריכוז 1× ולחדש את זרימת המשאבה עד שנותרו כ-5 mL במיכל המאגר.
   18. יש לחזור על שלבים 2.2.13 עד 2.2.16.
       הערה: ניתן לבצע אלוציה שלישית על ידי חזרה על שלבים 2.2.17 ו-2.2.13 עד 2.2.16 כדי להגדיל את תפוקת הווירוס. עם זאת, רוב הווירוס נמצא בשתי האלוציות הראשונות.
   19. בסיום האלוציות, יש להניח את הווירוס על קרח או ב-4 °C.
   20. כדי לנקות את הצינורות, יש להגדיר את המערכת כמעגל סגור (איור 3D), כאשר קווי הפסולת מזינים חזרה את המאגר, כפי שמתואר ב-איור 3D.
   21. יש לנקות את המערכת על ידי הוספת 250 mL של 0.5 M NaOH עם 40 ppm של הלבנה שחוממו מראש ל-42 °C.
   22. יש להזרים את תמיסת הניקוי דרך המערכת למשך לילה.
       הערה: בזמן סירקולציה של תמיסת הניקוי, אם המשאבה פועלת במהירות של 50 mL/min, נמדד לחץ של כ-5 psi. אם הלחץ עולה על כך, סימן שהקסטה מלוכלכת ויש להחליף את תמיסת הניקוי ולחזור על התהליך.
   23. יש לבצע אלוציה לתמיסת הניקוי על ידי הזרמת שני קווי הפסולת וקו הרטנטט אל כלי פסולת.
   24. יש להוסיף למאגר 40-50 mL של מים סטריליים ולהזרים אותם דרך המערכת אל כלי הפסולת.
   25. כאשר נותרו כ-5 mL במאגר, יש להשהות את המשאבה ולהוסיף למיכל המאגר 10-20 mL של 0.5 M NaOH, תוך סיבוב התמיסו לשטיפת מיכל המאגר.
   26. כאשר המאגר כמעט ריק, יש לחזור על שלב 2.2.23 פעמיים נוספות.
   27. יש לפרק את מערכת ה-TFF, ולאחסן את קסטת ה-TFF ואת האטמים בנפח קטן של 0.5 M NaOH בתוך שקית פלסטיק נסגרת ב-4 °C.
       הערה: ניתן לאחסן את הצינורות בטמפרטורת החדר כשהם טבולים ב-0.5 M NaOH.
3. אולטרסנטריפוגציה במדרג צפיפות של Iodixanol
   1. יש להדליק את האולטרסנטריפוגה ולהגדיר אותה לקירור מוקדם של 4 °C. יש לקרר מראש גם את הרוטור הרצוי ב-4 °C (ראה טבלת חומרים).
      הערה: יש לאחסן רוטורים ב-4 °C.
   2. השתמש בתמיסת iodixanol 60% מהמלאי (הריכוז בעת הרכישה) כדי להכין תמיסות iodixanol של 40%, 20% ו-10% על ידי דילול עם PBS ובאפר ML בריכוז 3× עד לריכוז סופי של 1× של באפר ML.
   3. בתוך מבחנה לאולטרסנטריפוגה בנפח 13.2 mL, בעלת קצה פתוח ודופן דקה, יש להניח שכבות של 0.5 mL, 2.5 mL ו-2.5 mL של תמיסות iodixanol בריכוזי 40%, 20% ו-10% בהתאמה (איור 4A).
      הערה: הטיית מבחנת האולטרסנטריפוגה הצידה וריקוע איטי של התמיסה יפחיתו משמעותית את הסיכון לערבוב בין שתי שכבות המדרג. ההפרדה בין כל שכבה צריכה להיות ברורה, עם "הילה" הנראית בין כל שכבה במדרג.
   4. יש להשתמש בטוש כדי לסמן את הממשקים של שכבות המדרג השונות.
   5. יש להניח 6-6.5 mL של הווירוס שהוצא באלוציה בתהליך ה-TFF מעל מדרג הצפיפות. יש להוסיף את הווירוס בזהירות כפי שמתואר בשלב 2.3.3 כדי לא להפריע למדרג הצפיפות.
   6. יש לטעון את מבחנות האולטרסנטריפוגה אל תוך התושבות עבור רוטור לסלי דליים (swinging bucket rotor) (ראה טבלת חומרים), תוך שימוש במאזניים בעלי קצה פתוח כדי לאזן את התושבות בטווח של 0.01 g אחת מהשנייה. השתמש ב-PBS או בתוספת של תמיסת וירוס אלואלית כדי לפצות על הבדלי המשקל.
   7. לאחר איזון המבחנות, יש לסגור אותן בפקקים ולהכניסן לרוטור.
   8. יש לבצע סנטריפוגה למשך 1.5 שעות ב-125,0 × g בטמפרטורה של 4 °C.
      הערה: ניתן לבצע זאת במהלך הלילה אם קיימת אולטרסנטריפוגה עם יכולת התנעה מושהה.
   9. בסיום האולטרסנטריפוגציה, יש להוציא את המבחנות באמצעות פינצטה סטרילית. חפש את פס היעד הגדול שבין מדרגי ה-10% וה-20% (איור 4B).
   10. יש לתלות את המבחנה מעל כלי כימי (beaker) באמצעות מעמד רטורט.
   11. יש לחבר מחט 18 G × 1.5-inch למזרק 5 mL ולנקב את דופן מבחנת האולטרסנטריפוגה.
       הערה: יש לנקב את המבחנה מעט מתחת לפס היעד, כאשר המחט בזווית כלפי מעלה והחלק החתוך (bevel) פונה למעלה, כך שהיא תיכנס אל פס היעד.
   12. יש להזיז לאט את הבוכנה כדי להוציא את פס היעד.
       הערה: יש להזיז את המחט בתוך פס היעד כדי למקסם את כמות הווירוס המופקת. יש להיזהר שפסים אחרים או פסולת לא יתערבבו עם פס היעד, ולהימנע מלקיחת תמיסה עודפת, שכן הדבר יוביל לשימוש ביותר קסטות דיאליזה.
   13. לאחר הפקת פס היעד, יש להוציא את המחט ולאפשר לשאר התמיסה להתנקז לכלי הפסולת. יש להעביר את פס היעד למבחנה קונית של 50 mL עד שכל הפסים מכל מבחנות האולטרסנטריפוגה הופקו.
   14. יש לחזור על שלבים 2.3.10-2.3.13 עד שכל פסי היעד הופקו מכל מבחנות האולטרסנטריפוגה.
   15. גישה חלופית להפקת פסי היעד כפי שמתואר בשלבים 2.3.10 עד 2.3.13
       1. הסר לאט את הנוזל המכסה את פס היעד באמצעות פיפטה. ברגע שהגעת לפס היעד, הפק אותו באמצעות פיפטה ואחסן את הווירוס במבחנה קונית של 50 mL.
          הערה: דרך זו מאפשרת שימוש חוזר במבחנות האולטרסנטריפוגה.
4. הסרת iodixanol מתמיסת הווירוס
   הערה: הפס המכיל NDV מופיע בצפיפות iodixanol שבין 15% ל-16%. ניתן לקבוע את ריכוז ה-iodixanol בתמיסה על ידי מדידת הבליעה (absorbance) ב-340 nm ביחס לעקומת סטנדרט. ניתן להשמיט שלב זה שכן לא נצפו השפעות שליליות או רעילות חריפה כאשר תמיסות iodixanol בריכוז זה הוכנסו לעכברי C57BL/6.
   1. יש להרטיב מראש קסטת דיאליזה של 0.5-3 mL עם סף חיתוך משקלי (molecular weight cut-off) של 10 kDa על ידי טבילה ב-PBS למשך דקה אחת.
      הערה: ממбраנת הדיאליזה צריכה להשתנות ממראה חלק למראה מקומט או בולט. אם נפח הווירוס המופק עולה על 10 mL, יש להשתמש בשתי קסטות דיאליזה של 0.5-3 mL או בקסטת דיאליזה אחת של 5-12 mL.
   2. במידת הצורך, השתמש במזרק של 5 או 10 mL ובמחט blunt-fill של 18 G × 1.5 inch כדי לאסוף את הווירוס מהמבחנה הקונית של 50 mL.
   3. השתמש במזרק כדי להיכנס לקסטת הדיאליזה, תוך זהירות לא לנקב את הממбраנה, והזרק את הווירוס.
      הערה: ניתן לסובב את קסטת הדיאליזה כדי לשלוט במיקום כיס האוויר בקסטה. יש להוציא את כיס האוויר לפני הוצאת המחט מהקסטה.
   4. מלא כלי כימי של 1 L ב-1× PBS סטרילי, הנח בתוכו מקשית (stir bar) ואת קסטת הדיאליזה, וכסה. הדגר ב-4 °C עם ערבוב עדין.
      הערה: השתמש בקצף פוליסטירן וגומיה כדי להצמיד את קסטת הדיאליזה כך שתצוף ב-PBS. הקסטה עשויה להתנפח מעט בשל באפר ה-ML.
   5. לאחר 1-2 שעות, החלף ב-1× PBS טרי והמשך להדגיר ב-4 °C למשך 8-10 שעות נוספות עם ערבוב קל.
      הערה: ניתן לבצע זאת גם במהלך הלילה.
   6. החלף שוב ב-1× PBS טרי, והדגר בטמפרטורת החדר למשך 1-2 שעות.
5. ריכוז תמיסת הווירוס
   1. הוצא את קסטת הדיאליזה מבאפר הדיאליזה (איור 4C) והנח אותה בתוך שקית פלסטיק קטנה הניתנת לסגירה. הוסף 15-25 mL של פוליאתילן גליקול 20,0 MW בריכוז 40%, כך שקסטת הדיאליזה תהיה טבולה לחלוטין.
   2. הדגר בטמפרטורת החדר עם נדנוד (rocking). בדוק את נפח הווירוס בקסטה מדי פעם באמצעות מזרק 5 או 10 mL ומחט blunt-fill של 18 G × 1.5 inch.
      הערה: משך הזמן הדרוש לריכוז הווירוס ישתנה בהתאם לנפח ההתחלתי ולנפח הסופי הרצוי. בדרך כלל, הנפח הסופי הרצוי הוא בין 1 ל-1.5 mL, ללא קשר לנפח ההתחלתי של נוזל האלנטואיס. בעת בדיקת הנפח, היזהר לא להשתמש באותו פתח, שכן הדבר יפגע בשלמות הפתח ועשוי להוביל לערבוב של תמיסת הפוליאתילן גליקול עם הווירוס.
   3. לפני הוצאת הווירוס המרוכז מקסטת הדיאליזה, שטוף קלות את הקסטה ב-1× PBS ומלא מחט blunt-fill של 18 G × 1.5 inch באוויר.
   4. הכנס את המזרק המלא באוויר לקסטת הדיאליזה ולחץ על הבוכנה. סובב את המכשיר כך שניתן יהיה להוציא את הווירוס המרוכז מבלי להוציא את האוויר שהוכנס.
   5. העבר את הווירוס המרוכז למבחנה קונית של 50 mL, ורשום את הנפח שהועבר.
   6. באמצעות אותו מזרק ומחט, הזרק כמות מתאימה של סוכרוז 60% לקסטת הדיאליזה, כך שכשייוחד עם הווירוס שהוצא קודם לכן, ריכוזו הסופי יהיה 5% סוכרוז.
   7. השתמש באצבעות עם כפפות כדי לעסות את הממбраנה כדי לשחרר וירוס שארי שייתכן שנדבק אליה, תוך זהירות לא לפגוע בה. הוצא חלק מהאוויר העודף בקסטת הדיאליזה כדי להקל על תהליך השחרור.
   8. שלב שטיפה זו עם הווירוס שכבר נמצא במבחנה הקונית של 50 mL.
      הערה: הווירוס נמצא כעת ב-5% סוכרוז ומוכן להעברה לאליקוויטות של 20 µL, 50 µL, 10 µL או 20 µL ולאחסון ב-80 °C-. לחלופין, לאחסון לטווח ארוך, ניתן לבצע ליופיליזציה ל-NDV ולאחסנו ב-4 °C כפי שמתואר בסעיף 2.6.

תוצאות

איור 1: הדבקה וקציר של NDV מביצי תרנגולת עובריות נקיות מפתוגנים מוגדרים. (A) וסקולטורה דמוית רשת (חצים) צריכה להיות גלויה לאחר 9 ימי דגירה, בנוסף לתנועת העובר. 'X' מסמן את הממשק בין קרומי הכוריואלנטואיס לבין חל האוויר, ושם יש...

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה

שם	חברה	מספר קטלוג	הערות
מזרק 1 מ"ל עם קצה החלקה (Slip-Tip)	BD	309659
מזרקה עם חיבור Luer-Lok בנפח 10 מ"ל	BD	302995
תמיסת פובידון יוד 10%	לוֹרִיס (LORIS)	109-08
מבחנות קוניות של 15 מ"ל	Thermo-Fisher	14955240
מחט מילוי קהה בגודל 1 1/2 אינץ', 18G	BD	305180
מחט Precision Glide בגודל 18G x 1 1/2 אינץ'	BD	305196
מחט 25 G x 5/8 אינץ'	BD	305122
מזרק Luer-Lok בנפח 5 מ"ל	BD	309646
חומצה אצטית, גלציאלית	Thermo-Fisher	A38-212
אגרוז	Froggabio	A87-50G
Alexa-Fluor 48 Goat-Anti-Mouse	Invitrogen	A101
צנטריפוגה Allegra X-14	Beckman Coulter	B0861
אמוניום פרסולפט	BioRad	161-0700
תמיסת הלבנה (5%)	Thermo-Fisher	36-102-0599
פינצטה רחבה בעלת קצוות ללא שיניים	Thermo-Fisher	09-753-50
ברומופנול בלו (Bromophenol Blue)	Sigma-Aldrich	1405-25G
מחזיק קסטות Centramate	PALL	CM018V
ChemiDoc XRS+	BioRad	1708265
מדגרה לביצים Digital 1502 Sportsman	ברי היל	1502W
D-מניטול	Sigma-Aldrich	M4125-50G
מכשיר לבדיקת ביצים (Egg Candler)	ברי היל	A46
אתנול (70%)	Thermo-Fisher	BP82031GAL
מחברי T עם הברגה פנימית, ניילון, 1/8 אינץ' NPT(F)	Cole-Parmer	06349-50
ערכה לבדיקת לחות	ברי היל	3030
איודיקסנול	Sigma-Aldrich	D156	תמיסה של 60% (משקל/נפח) של iodixanol במים (סטריליים)
L-Lysine Monohydrochloride	Sigma-Aldrich	62929-100G-F
Luer-Lok זכר ונקבה עם הברגת צינור לאומית (NPT) בקוטר 1/8 אינץ'	Cole-Parmer	41507-44
מנוע דיגיטלי Masterflex L/S	Cole-Parmer	RK-0752-20	משאבה פריסטלטית עם תצוגה דיגיטלית
ראש משאבה Masterflex L/S Easy Load עבור Tubing מדויק	Cole-Parmer	RK-07514-10
צינור סיליקון Masterflex (פלטינה) L/S 16	Cole-Parmer	96420-16	סיליקון BioPharm עם פסיקה פלטינית (Platinum-Cured)
קסטת Omega Membrane LV Centramate, 10K	PALL	OS10T02
אולטרסנטריפוגה Optima XE-90	Beckman Coulter	A9471
תמיסת PBS בריכוז 10X	Thermo-Fisher	BP39-20
פוליאתילן גליקול (Poly(Ethylene Glycol)) ממוצע Mn 20,0	Sigma-Aldrich	8130-1KG
קסטת דיאליזה Slide-a-lyzer (בעוצמה גבוהה), 10,00 MWCO 0.5-3 מ"ל	Thermo-Fisher	66380
נתרן הידרוקסיד (גרגירים)	Thermo-Fisher	S318-10
ביצים חופשיות מפתוגנים ספציפיים (SPF)	CFIA	לא רלוונטי	הספק ישתנה בהתאם למיקום
סוכרוז	Thermo-Fisher	S5-3
מסנן עומק Supracap 50	PALL	SC050V10P
מספריים כירורגיים	Thermo-Fisher	08-951-5
רוטור Sw41Ti	Beckman Coulter	331362	בשימוש בשלבים 2.3.1, 2.3.6, 2.3.7 של הפרוטוקול
רוטור SX4750	Beckman Coulter	369702
מתאם SxX4750 למבחנות בעלות תחתית קונית	Beckman Coulter	359472
מבחנות צנטריפוגה Ultraclear בעלות דופן דקה (9/16 אינץ' x 3 1/2 אינץ')	Beckman Coulter	344059
מהבץ בורג לצינור	PALL	88216
מדי לחץ כלליים	Cole-Parmer	68355-06