כל ההליכים הכוללים איסוף דגימות בוצעו בהתאם להנחיות ה-IRB של המכון. 1. טרנסדוקציה באמצעות נגיף סנדאי (Sendai Virus) טרנסדוקציה (יום 0) יש לאסוף ולהעביר את תאי הדם לשפופרת קונית של 15 מ"ל ולספור אותם באמצעות המוציטומטר. יש להכין 3x10⁵ תאים לכל טרנסדוקציה ולסובב את התאים בצנטריפוגה ב-515 x g למשך 5 דקות בטמפרטורת החדר (RT). יש להסיר את הנוזל העליון באמצעות שאיבה ולהשעות מחדש את התאים ב-0.5 מ"ל של מצע לתאי דם. יש להעביר את התאים לבאר של פלטת 24 בארות שאינה מצופה. יש להפשיר את תערובת נגיף הסנדאי בקרח ולהוסיפה לתאים המושעים. יש להוסיף את נגיף הסנדאי לתאים על פי המלצות היצרן. יש לאטום את הפלטה באמצעות סרט איטום ולסובב אותה בצנטריפוגה ב-1,150 x g למשך 30 דקות ב-30 °C. לאחר הסבוב בצנטריפוגה, יש לדגור את התאים ב-37 °C בריכוז של 5% CO2 למשך לילה (O/N). העברת תאים למטריצת הזנה (יום 1) ביום למחרת, יש לצפות פלטת 24 בארות בוויטרונקטין (vitronectin). יש לדלל את תמיסת הוויטרונקטין ב-PBS לריכוז סופי של 5 µg/ml. יש להוסיף 1 מ"ל של ויטרונקטין לבאר של פלטת 24 בארות ולדגור בטמפרטורת החדר למשך שעה אחת לפחות. יש להסיר את תמיסת הציפוי לפני השימוש. ניתן לאחסן פלטות מצופות בטמפרטורת החדר למשך 3 ימים. יש להעביר את כל המצע המכיל את התאים והנגיף לבאר המצופה. יש לאסוף את התאים שנותרו עם 0.5 מ"ל נוספים של מצע טרי לתאי דם ולהוסיפם לבאר המכילה את התאים. יש לסובב את הפלטה בצנטריפוגה ב-1,150 x g למשך 10 דקות ב-35 °C. לאחר הסבוב בצנטריפוגה, יש להסיר את הנוזל העליון, להוסיף 1 מ"ל של מצע iPSC ולשמור את התאים ב-37 °C בריכוז של 5% CO2 למשך לילה. העברת תאים שנייה (יום 2) יש לצפות את בארותיה של פלטת 24 בארות חדשה ב-5 µg/ml ויטרונקטין, כפי שמתואר בשלב 1.2.1. יש להשתמש בבאר אחת מהפלטה לכל טרנסדוקציה. יש להעביר את תרחיף התאים מהפלטה הראשונה לפלטת הוויטרונקטין המצופה החדשה. הערה: במידה ואין בהם צורך, ניתן להשליך את התאים המושעים. ניתן לחזור על ההליך המוזכר בשלב 2.3 פעמיים-שלוש עם התאים המושעים. במידה והשלבים חוזרים על עצמם, יש לקצור את התאים. במקביל, יש להוסיף 1 מ"ל של מצע iPSC (תאי גזע פלוריפוטנטיים מושריים) לבאר של הפלטה הראשונה, לצורך תחזוקה, ולדגור ב-37 °C בריכוז של 5% CO2 למשך לילה. יש לתחזק את התאים ההיצמדים ב-37 °C וב-5% CO2 ולבצע החלפת מצע יומית במצע iPSC טרי. מושבות יופיעו בימים 14-21 לאחר הטרנסדוקציה. יש לסובב את הפלטה המצופה החדשה המכילה את התאים המושעים בצנטריפוגה ב-1,150 x g וב-35 °C למשך 10 דקות. לאחר הסבוב בצנטריפוגה, יש לדגור את התאים ב-37 °C בריכוז של 5% CO2 למשך לילה. ביום למחרת, יש להסיר את הנוזל העליון ולהחליפו במצע iPSC טרי. הערה: ניתן לחזור על ההליך המוזכר בשלב 1.3 פעמיים-שלוש עם התאים המושעים. במידה והשלבים יחזרו על עצמם, יש לקצור את התאים מהנוזל העליון ולחזור על שלב 1.3. יש לתחזק את התאים ההיצמדים באמצעות החלפות מצע יומיות עד להשגת 80% התלכדות (confluency). .Rim, Y. A וכו' הפקת תאי גזע פלוריפוטנטיים מושראים מתאי דם באמצעות וירוס סנדאי וסנטריפוגציה. J. Vis. Exp. (2016).
סרטון זה מדגים יצירה של תאי גזע פלוריפוטנטיים מושריים (iPSCs) מתאי מונונוקלאר של דם פריפריאלי אנושי באמצעות תכנות מחדש המתווך על ידי נגיף סנדאי (Sendai virus). גורמי השעתוק הוויראליים מפעילים רשתות פלוריפוטנטיות ומדכאים גנים של שושלות תאים, מה שמאפשר לתת-קבוצה של תאים לרכוש תכונות היצמדות ולהקים מושבות iPSC. הפרוטוקול מעשיר ומתחזק תאים מתוכננים מחדש אלו באמצעות קישור סלקטיבי למטריצה וחידוש יומי של המדיום.
