ניתוח הפנמה של נגיף השפעת באמצעות בדיקת חסימת סטראפטאווידין

תקציר

מקור: Pohl, M. O. & Stertz, S. מדידת היצמדות והפנמה של נגיף השפעת A בתאי A549 באמצעות ציטומטריית זרימה. J. Vis. Exp. (2015)

סרטון זה מדגים את השימוש במבחן חסימה של סטרפטאווידין כדי להבחין בין נגיף השפעת קשור לפני השטח לבין נגיף שהופנם לתאי אפיתל של ריאה אנושית. השוואה בין אותות פלואורסצנציה מראה כי עוצמה גבוהה יותר לאחר אינקובציה מעידה על הפנמה ויראלית מוצלחת.

פרוטוקול

1. בדיקת היצמדות/הפנמה

הערה: וודאו שכל الريאגנטים מוכנים לפני תחילת הבדיקה. עבור שלוש קבוצות הביקורת המוצגות בסעיף התוצאות (תאים ללא זיהום/mock-infected, תאים שעובדו מראש עם neuraminidase ותאים שעובדו עם sodium azide), נדרשים שינויים קלים בפרוטוקול.

1. הכינו 16 מבחנות deepwell, שכל אחת מהן מכילה 200,000 תאי A549. לצד הסט הניסויי המורכב מ-4 מבחנות, ישנם 3 תנאי ביקורת, שכל אחד מהם דורש 4 מבחנות: תאים בביקורת זיהום מדומית (mock-infected), תאים שעברו טיפול מקדים בנוראמינידאז (NA) ותאים שעובדו בנתרן אזיד. כל קבוצה מורכבת מ-4 מבחנות המסומנות כ-'0 min', '0 min + streptavidin (STV)', '30 min', '30 min + STV'.
2. סבבו את המבחנות ב-4 °C במשך 3 min ב-450 x g. הסירו את העלייה (supernatant) והשביו מחדש את המשקע ב-200 µl של phosphate-buffered saline (PBS).
3. סבבו את המבחנות ב-4 °C ב-450 x g. הסירו את העלייה והשביו מחדש את המשקע ב-200 µl של Dulbecco's modified Eagle medium (DMEM) המכיל 0.3% bovine serum albumin (BSA), 20 mM 4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazineethanesulfonic acid (HEPES) ו-1% penicillin-streptomycin (תווך דגירה). דגרו למשך 30 min ב-37 °C.
   הערה: עבור ביקורת הנוראמינידאז: השתמשו בנוראמינידאז חיידקי (למשל sialidase מ-Vibrio cholera) בריכוז של 200 mU/ml המדולל בתווך דגירה להשביה מחדש של התאים.
4. סבבו את המבחנות ב-4 °C במשך 3 min ב-450 x g. הסירו את העלייה והשביו מחדש את המשקע ב-200 µl PBS. חזרו על שלב זה פעם נוספת, ולאחר מכן קררו את המבחנות על קרח למשך 10 min.
5. סבבו את המבחנות ב-4 °C במשך 3 min ב-450 x g. הסירו את העלייה והשביו מחדש את המשקע ב-100 µl של נגיף ביוטינילי (השתמשו בריכוז הנגיף שנקבע בסעיף 2 המדולל ב-infection-PBS). דגרו שעה אחת על קרח.
6. סבבו את המבחנות ב-4 °C במשך 3 min ב-450 x g. הסירו את העלייה והשביו מחדש את המשקע ב-200 µl PBS. חזרו על שלב זה פעם נוספת.
   הערה: עבור ביקורת הזיהום המדומה: השתמשו ב-infection-PBS ללא נגיף. עבור ביקורת נתרן האזיד: השתמשו בנגיף המדולל ב-infection-PBS המועשר ב-0.1 % נתרן אזיד.
7. עיבוד הדגימות לאחר ההדבקה על קרח:
   1. עבור דגימות ה-'0 min', בצעו את שלב 2.5 ואחסנו את הדגימות ב-4 °C עד ששאר הדגימות יעברו קיבוע.
   2. עבור דגימות ה-'0 min + STV', סבבו את המבחנות ב-4 °C במשך 3 min ב-450 x g. הסירו את העלייה והשביו מחדש את המשקעים ב-50 µl STV (השתמשו בריכוז שנקבע בסעיף 3) המדולל ב-PBS המכיל 2% BSA ו-0.1% נתרן אזיד (כדי למנוע הפנמה במהלך טיפול בדגימה). דגרו 30 min על קרח.
   3. סבבו את המבחנות ב-4 °C במשך 3 min ב-450 x g. הסירו את העלייה והשביו מחדש את המשקע ב-200 µl PBS. חזרו על שלב זה פעם נוספת.
   4. עבור קיבוע, סבבו את המבחנות ב-4 °C במשך 3 min ב-450 x g. הסירו את העלייה והשביו מחדש את המשקע ב-100 µl של 3.7% paraformaldehyde (PFA). דגרו למשך 10 min ב-RT. לאחר מכן, חזרו על שלב השטיפה המתואר בסעיף 1.6 ואחסנו את הדגימות ב-4 °C.
   5. עבור דגימות ה-'30 min', סבבו את המבחנות ב-4 °C במשך 3 min ב-450 x g. הסירו את העלייה והשביו מחדש את המשקע ב-200 µl PBS המכיל 2% BSA. דגרו 30 min ב-37 °C. בצעו את שלבים 1.7.3-1.7.4 ואחסנו את הדגימות ב-4 °C.
      הערה: עבור ביקורת נתרן האזיד: השתמשו ב-PBS המועשר ב-2 % BSA ו-0.1 % נתרן אזיד עבור הדגירה של 30 min ב-37 °C.
   6. עבור דגימות ה-'30 min + STV', סבבו את המבחנות ב-4 °C במשך 3 min ב-450 x g. הסירו את העלייה והשביו מחדש את המשקע ב-200 µl PBS המכיל 2% BSA. דגרו 30 min ב-37 °C. לאחר מכן, סבבו את המבחנות ב-4 °C במשך 3 min ב-450 x g. הסירו את העלייה והשביו מחדש את המשקעים ב-50 µl STV (השתמשו בריכוז שנקבע בסעיף 3) המדולל ב-PBS המכיל 2% BSA ו-0.1% נתרן אזיד (כדי למנוע הפנמה במהלך טיפול בדגימה). דגרו 30 min על קרח. בצעו את שלבים 1.7.3-1.7.4 ואחסנו את הדגימות ב-4 °C.
      הערה: עבור ביקורת נתרן האזיד: השתמשו ב-PBS המועשר ב-2 % BSA ו-0.1 % נתרן אזיד עבור הדגירה של 30 min ב-37 °C.
8. עבור פרמיליזציה, סבבו את המבחנות ב-4 °C במשך 3 min ב-450 x g. הסירו את העלייה והשביו מחדש את המשקע ב-100 µl PBS המכיל 0.5% Triton X-100. דגרו למשך 6 min ב-RT. לאחר מכן, חזרו על שלב השטיפה המתואר בסעיף 1.6).
9. סבבו את המבחנות ב-4 °C במשך 3 min ב-450 x g. הסירו את העלייה והשביו מחדש את המשקע ב-50 µl של 2% BSA המדולל ב-PBS המכיל STV-Cy3. (שימו לב, יש לקבוע את הריכוז המתאים של STV-Cy3 לפני תחילת הניסוי. התחילו בריכוז של 1:200 ובדקו מיהולי 2-fold עד ל-1:2,400. בבדיקותינו, מיהול של 1:1,000 נמצא כאופטימלי).
10. דגרו שעה אחת בחושך ב-RT. לאחר מכן, חזרו על שלב השטיפה המתואר בסעיף 1.6 אך השביו את המשקע ב-200 µl של 2% BSA המדולל ב-PBS.
11. נתחו את הדגימות באמצעות ציטומטריה של זרימה (flow cytometry). קבעו את אחוז התאים החיוביים ל-Cy3 בכל דגימה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה

שם	חברה	מספר קטלוג	הערות
DMEM	Life Technologies	41966-052
FBS	Life Technologies	10270-106
פניצילין-סטרפטומייצין	Life Technologies	15140-163
PBS	Life Technologies	14190-169
BSA	VWR Calbiochem	126579
HEPES	Life Technologies	15630-100
D-Sucrose	Fluka	84100
Bio Rad Protein Bio Assay	Bio Rad	500-0006
מבחנות עמוקות (מיקרו-מבחנות 1.2 ml)	Milian	82 00 001
PFA	Lucerna chem Electron microscopy sciences	15710
מבחנות לאולטרסנטריפוגה	Hemotec HmbH	253070
Triton X-100	Fluka	93420
STV-Cy3	Life Technologies	43-4315
STV	Life Technologies	43-4302
סודיום אזייד	Fluka	71290
נורימינזידאז/סיאלידאז חיידקי	Sigma-Aldrich	N6514-1UN