הערכת עיכוב גדילה בקטריאלית בתיווך פאגים באמצעות מדידות צפיפות אופטית

תקציר

מקור: Niu, Y. D., ואחרים. הערכת יעילותם של בקטריופאגים לבקרת ביולוגית של פתוגנים המועברים במזון באמצעות מערכים לסריקה רב-מסית. J. Vis. Exp. (2021)

סרטון זה מדגים בדיקה מבוססת מיקרופלטה להערכת הפעילות הליטית של תערובות פאג'ים נגד תרביות חיידקי E.coli. הוא מדגיש כיצד שינויים בצפיפות האופטית חושפים את עוצמת הפאג'ים ואת הריכוז הדרוש לעיכוב חיידקי מלא

פרוטוקול

1. הכנת תמיסות באפר וריאגנטים

1. הכינו 500 mL של ציר סויה טריפטי (TSB) (15 g של אבקת TSB ו-500 mL של מים אולטרה-טהורים) ועקרו באוטוקלאב.
   הערה: ניתן לאחסן את התמיסה בטמפרטורת החדר למשך עד 3 חודשים או ב-4 °C למשך עד 6 חודשים.
2. הכינו 500 mL של אגר סויה טריפטי (TSA) (20 g של אבקת TSA ו-500 mL של מים אולטרה-טהורים) ועקרו באוטוקלאב.
   הערה: ניתן לאחסן את התמיסה ב-4 °C למשך עד 3 חודשים.
3. הכינו 500 mL של פוספט בופר מלוחי (PBS; 4 g של NaCl, 0.1 g של KCl, 0.77 g של Na₂HPO₄, ו-0.12 g של KH₂PO₄, 500 mL של מים אולטרה-טהורים), מדדו והתאימו את ה-pH ל-7.2 ± 0.2 ב-25 °C ועקרו באוטוקלאב.
   הערה: ניתן לאחסן את התמיסה ב-4 °C למשך עד 6 חודשים.
4. הכינו 200 mL של 1 M MgSO₄ (49.294 g ו-200 mL של מים אולטרה-טהורים) ועקרו באמצעות מסנן פוליאתרסולפון של 0.22 µm.
5. הכינו 500 mL של TSB עם 10 mM MgSO₄ (mTSB; 15 g של אבקת TSB, 500 mL של מים אולטרה-טהורים, ו-5 mL של 1 M MgSO₄) ועקרו באוטוקלאב; הניחו למצע שעוקר באוטוקלאב להתקרר לטמפרטורת החדר. השתמשו בטכניקה אספטית. בעזרת פיפט סרולוגית, העבירו בזהירות 5.0 mL של 1 M MgSO₄; ערבבו בעדינות בתנועות סיבוביות.

2. הכנת תרבית חיידקים

1. להכנת תרבית מעבדה למחקר חיידקים (BRLC), הוצא את מבחנות מאגר הגליצרין מהמקפיא והעבר אותן למעבדה.
2. השתמש בלולאת הזרקה חד-פעמית או במקבילה לה, טבול אותה במבחנה, קח מעט מהאינוקולום (עיסה קפואה), ובצע מריחה על צלחת TSA או מקבילה לה בתוך קבינה לבטיחות ביולוגית ברמה II. דגרי את הצלחת בטמפרטורה של 37 ± 2 °C למשך 15−18 שעות.
3. הכנס את צלחות ה-BRLC שהוכנו לשקיות ואחסן בטמפרטורה של 4 °C.
   הערה: תקופת תפוגה כללית ל-BRLC: 14 ימים ב-4 °C לאחר ההכנה.
4. הזרק מושבה בודדת של כל זן E. coli O157 מתוך צלחות ה-BRLC המיועדות לבדיקה לתוך 10 mL של TSB, ודגרי באופן סטטי ב-37 °C למשך 18 שעות כדי להגיע לריכוז של 9 log10 CFU/mL.
5. הכן דילול סדרתי של תרביות הלילה (בבוקר למחרת), עבור כל זן E. coli O157, תוך שימוש ב-mTSB המכיל 10 mM של MgSO₄ כדי להגיע ל-4-5 log10 CFU/ml (או לרמת אינוקולום רצויה אחרת).
6. ערבב נפחים שווים של תרבית לילה מכל זן כדי להגיע לסך כולל של 4-5 log10 CFU/mL (או לפי הרצוי) להכנת התערובת החיידקית.
7. הצב מיד את התרבית החיידקית המדוללת בטמפרטורה של 4 °C עד לשימוש.
8. דלל את תרבית האינוקולום פי 10 או 100, ופזר מנות של 0.1 mL מדילול זה על צלחות TSA כדי לקבל מושבות מבודדות.

3. הכנת תמיסות עבודה של פאגים

1. הרבה מלאי עבודה בריכוז גבוה עבור כל פאג שיועמד לבדיקה (≥108 PFU/mL) בהתאם לשיטות הסטנדרטיתות4.
   הערה: תקופת התפוגה הכללית עבור מלאי הפאגים היא 3 חודשים בבקבוק פלסטיק ב-4 °C לאחר ההפקה.
2. כדי להגיע לריכוז הרצוי, למשל, ~10⁸ PFU/mL עבור קינטיקה של ליזיס, דללו תכשירי פאג בודדים עם mTSB המכיל 10 mM של MgSO₄. הכינו תערובות פאגים (cocktails) על ידי ערבוב של נפחים שווים מכל מלאי עבודה בעל ריכוז זהה בכל השילובים האפשריים.

4. הכנת in-vitro קינטיקת ליזיס עבור פאג'ים בודדים ותערובות פאג'ים

1. הכינו דילולות סדרתיות של פי 10 עבור כל פאג בעמודות 1-8 בלוחות מיקרו-פלייט סטריליים בעלי 96 בארות להקמת בדיקת המיקרו-פלייט.
   הערה: ניתן לבחון ארבעה פאגים נגד זן חיידקי אחד בכפילות, בעמודות סמוכות, בכל לוח. ארבעת העמודות הנותרות משמשות כביקורות, ללא פאג, וכן כביקורת ריק של mTSB (איור 1).
2. העבירו 180 µL של mTSB לבארות בעמודות 1 עד 12 בלוח המיקרו-פלייט בעל 96 הבארות.
3. הוסיפו 20 µL של פאגים בודדים מדוללים או תערובות פאגים (~108 PFU/mL) לבארות 1-8 בשורה העליונה של לוח המיקרו-פלייט (שורה A).
4. עבור ביקורת ללא פאג וביקורת הריק, הוסיפו 20 µL של mTSB לבאר העליונה של עמודות 9, 10 ו-11.
5. בבעזרת פפיטה בעלת 12 ערוצים, בצעו את דילול הלוח. העבירו 20 µL משורה לשורה. ערבבו היטב את התוכן באמצעות שאיבה ופליטה חוזרת ועדינה (לפחות חמש פעמים), והחליפו טיפים בין הדילולות. הסירו 20 µL מהשורה האחרונה (שורה H).
   הערה: מומלץ להשתמש בטיפים עם מסננים כדי למנוע זיהום צולב.
6. הכינו מיכל (reservoir) עבור כל זן. השתמשו בפפיטה של 1 mL כדי להעביר 2-3 mL של התרבית המדוללת למיכל. עבור עמודות 1-10, השתמשו בפפיטה רב-ערוצית כדי להוסיף 20 µL של התרבית החיידקית המדוללת לכל בארה. החליפו טיפים בין כל הוספה.
7. כסו והדגירו את לוח המיקרו-פלייט בתנאים הרצויים (למשל, 37 °C למשך 10 h או 22 °C למשך 22 h).
8. בנקודת זמן של 2 h או במרווחי זמן רצויים אחרים, הוציאו את לוחות המיקרו-פלייט מהאינקובטור.

תוצאות

איור 1: פריסה מוצעת של בדיקת מיקרופלטה בעלת 96 בארות. דילול סידורי של 10-fold לכל פאג מוכן בעמודים 1-8 של מיקרופלטות סטריליות בעלות 96 בארות. ניתן לבחון ארבעה פאגים נגד זן חיידקי אחד בכפולות, בעמודים סמוכים, בכל פלטה. העמודים הנותרים משמשים כביקורות.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה

שם	חברה	מספר קטלוג	הערות
ציוד, ריאגנטים וחומרים חיוניים
מגנזיום סולפט פפטהידראט	Sigma	1374361
Pipet-Lite LTS Pipette L-1000XLS+	METTLER TOLEDO	17014382
Pipet-Lite LTS Pipette L-300XLS+	METTLER TOLEDO	17014405
Pipet-Lite Multi Pipette L12-20XLS+	METTLER TOLEDO	17013808
פיפט Pipet-Lite, דגם Unv. SL-20XLS+	METTLER TOLEDO	17014412
טיפים לפיפט RT LTS 1000µL FL 768A/8-low retention	METTLER TOLEDO	30389213
טיפים לפיפט SR LTS 20µL F 960A/5	METTLER TOLEDO	17005860
מאגר	METTLER TOLEDO	89094-662
פלטות מיקרופוליסטירן סטריליות ושקופות בעלות 96 בארות עם תחתית שטוחה ומכסים	Fisher	168055
אגר סויה טריפטי (TSA)	Sigma	105458-0500
ציר סויה טריפטי (TSB)	Sigma	105459-0500
פורסי תאים בצורת T	VWR	76299-566
מכשירים
אינקובטורים מיקרוביולוגיים קומפקטיים	Fisher	50125590H
מגנטים לבחישה בצורת פוליגון	Fisher	14-512-125	אורך: 20 ממ"ק
קורא רב-מצבי היברידי Synergy Neo2	Fisher	BTNEO2M
תוכנה
SAS	SAS Institute	9.4