סימון של גנומים משתכפלים של HSV-1 באמצעות אנלוג נוקלאוזידי

תקציר

מקור: Dembowski, J. A., Deluca, N. A. טיהור של DNA נגיפי לזיהוי של חלבונים נגיפיים ותאיים נלווים. J. Vis. Exp. (2017)

סרטון זה מדגים הדבקה של תאי יונקים בשלב סטציונרי ב-HSV-1 (Herpes Simplex Virus-1), ולאחריה שכפול של הגנום הוויראלי באמצעות מנגנוני השכפול של המארח והווירוס. אנלוג נוקלאוזידי סינתטי נטמע ב-DNA ויראלי שסונתז לאחרונה כדי לסמן גנומים בשכפול, אשר מבודלים לאחר מכן לצורך אנליזה פרוטאומיקה של חלבוני המארח והווירוס הקשורים אליהם.

פרוטוקול

1. תרבית תאים, הדבקה נגיפית וסימון ב-EdC (5-Ethynyl-2′-deoxycytidine) (איור 1)

הפרוטוקול הבא כולל עבודה עם נגיפים. אנא עיינו בפרוטוקולי הביו-בטיחות של המוסד שלכם בנוגע לטיפול בטוח בנגיפים ובסוכנים ביולוגיים אחרים. פרוטוקול זה אושר על ידי הוועדה לביקורת מוסדית (IRB) של אוניברסיטת פיטסבורג.

1. בצעו טריפסינזציה לבקבוק תרבית רקמה של 150 cm² בעל שכבת תאים רציפה (confluent) של תאי MRC-5 (Medical Research Council cell strain 5), והעבירו את התאים לצלחת תרבית רקמה של 600 cm2 המכילה 100 mL DMEM (Dulbecco's Modified Eagle Medium) בתוספת 10% FBS. דגרו ב-37 °C בנוכחות 5% CO₂ למשך 3-4 ימים עד להגעה לרציפות ולשלב סטציונרי. צלחת רציפה של 600 cm2 מכילה כ-7 x 10⁷ תאים. הכינו צלחת אחת לכל תנאי וצלחת אחת לכל ביקורת שלילית תואמת.
   הערה: התאים חייבים להגיע לשלב הסטציונרי כדי לעכב את השכפול של ה-DNA התאי, וזאת כדי להבטיח שרק vDNA (DNA ויראלי) יסומן ויטוהר בשלבים הבאים.
   הערה: לכל דגימה נדרשת ביקורת שלילית משלימה לא מסומנת, שתוכן תוכנה תחת אותם תנאי הדבקה ונקודת זמן, ללא הוספת EdC.
   הערה: יש לבצע גרסה מוקטנת של ניסוי זה במקביל כדי לבחון סימון של DNA תאי באמצעות דימוי (imaging), תוך שימוש בצמיחת תאים, הדבקה, תנאי סימון EdC ונקודות זמן דומות (ראו שלב 2).
2. דללו 7 x 10⁸ PFU (plaque-forming units) של HSV-1 ב-7 mL של Tris-Buffered Saline (TBS) קר. הסירו את מצע הגידול ואחסנו ב-37 °C. לצורך ההדבקה, הוסיפו את הוירוס המדולל (7 mL) לתאי MRC-5 ונערו בעדינות (rock) למשך שעה אחת בטמפרטורת החדר. לאחר הספיחה (adsorption), הסירו את האינוקולום, שטפו עם 50 mL TBS בטמפרטורת החדר, והחזירו את מצע הגידול המקורי. דגרו ב-37 °C בנוכחות 5% CO₂. שלב זה יבוצע עבור כל תנאי ניסויי ועבור הביקורת השלילית.
   הערה: ניתן להשיג סימון EdC מוגבר באמצעות מוטנטים של HSV-1 הפגומים בביטוי של dUTPase ויראלי (גן UL50) ו/או uracil glycosylase (גן UL2). ל-HSV-1 dUTPase ספציפיות נמוכה לסובסטרט, והוא עלול להפחית את ההפעלה של מספר אנלוגים של נוקלאוזיד.
3. סמנו גנומים ויראליים באמצעות EdC. פעלו לפי ההנחיות לסימון גנומים נכנסים (1.3.1.), גנומים משתכפלים (1.3.2.), או מזלגות שכפול ויראליים (1.3.3.).
   הערה: יש לבצע רק את שלב 1.3.1, 1.3.2 או 1.3.3, בהתאם לשאלה האם גנומים נכנסים, גנומים משוכפלים או מזלגות שכפול ינותחו בשלבים הבאים, בהתאמה.
   הערה: ניתן להחליף את ה-EdC ב-EdU או f-ara EdU. יש לנטר ולמזער את הרעילות של אנלוגים של נוקלאוזיד.
   1. השתמשו במאגרים שסומנו מראש לביצוע ההדבקה בשלב 1.2 והמשיכו לשלב 2 או 3 בתוך 4 שעות לאחר ההדבקה (hpi) כדי לבחון vDNA שטרם שוכפל (איור 1A).
      הערה: הכינו מאגרי וירוס שסומנו מראש באמצעות הפרוטוקול המתואר קודם לכן25. יש להעביר את מאגרי הוירוס דרך עמודת G-25 כדי להסיר שאריות של EdC.
   2. סמנו vDNA משתכפל על ידי הוספת 5 - 25 µM EdC למצע תרבית התאים של התאים המודבקים למשך 2 - 4 שעות (איור 1B). לפני ההוספה, דללו את ה-EdC ב-1 mL של מצע גידול.
   3. לסימון מזלגות שכפול ויראליים, לאחר תחילת שכפול ה-vDNA (ב-hpi ≥ 4), בצעו סימון פולס (pulse label) ל-vDNA משתכפל עם 5 - 25 µM EdC למשך 5-20 דקות. לצורך ה-chase, שטפו 3 פעמים עם מצע chase המכיל 25 - 100 µM 2´deoxycytidine (deoxyC), ולאחר מכן דגרו בנוכחות מצע chase למשך 20-40 דקות נוספות (איור 1C).
      הערה: יש להביא את מצעי ה-pulse וה-chase לשיווי משקל ב-37 °C וב-5% CO₂ לפני השימוש.
      הערה: בניסויי pulse-chase, חשוב להתחשב בזמן שלוקח לנוקלאוזידים להיכנס לתא ולעבור פוספורילציה לפני שיוכלו להשתלב ב-DNA משתכפל. יש לקבוע זאת באופן אמפירי.
      הערה: כדי לקבוע את הרזולוציה של ניסויי pulse-chase, חשבו את קצב השכפול הוויראלי תחת התנאים הניסויים שבהם השתמשתם. ניתן לקבוע זאת על ידי PCR כמותי של גנומים ויראליים במהלך מהלך זמן של צמיחה בשלב אחד (single step growth time course).

תוצאות

איור 1: גישות לסיומון DNA של HSV-1. (A) כדי לבחון את מצבו של נגיף הנכנס, תאי MRC-5 במצב מנוחה ב-G0 מודבקים ב-HSV-1 שסומן מראש, והגנומים נבחנים בפחות מ-4 hpi כדי ללמוד על DNA נגיפי שטרם שוכפל. (B) כדי לבחון את מצבו של נגיף ששוכפל, תאי MRC-5 מודבקים ב-HSV-1 שאינו מסומן, ו-EdC (כוכבים כתומים) מתווסף למצע הגידול של התאים המודבקים ומודגרה למשך 2 - 4 שעות לאחר תחילת השכפול של ה-DNA הנגיפי (≥4 hpi). (C) כדי לבחון מזלג שכפול נגיפיים, תאים מודבקים עוברים סיומון פולס (pulse label) עם EdC למשך 5-20 דקות. לאחר מכן ניתן לבצע מרדף (chase) של מזלגי השכפול עם deoxyC. DNA המסומן ב-EdC מופיע בכתום. איור זה עובד מ-Dembowski and DeLuca

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה

שם	חברה	מספר קטלוג	הערות
תאי MRC-5	ATCC	CCL-171
סרום בקר עוברי (FBS)	Gibco	26140-179
מדיום Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM)	Gibco	12800-082	מועשר ב-10% FBS, 2 mM L-glutamine, 12 mM (לגידול בבקבוקים) או 30 mM (לגידול בצלחות) sodium-bicarbinate
צלחת לתרבית רקמה 600 cm²	Thermo Fisher Scientific	166508
מלח Tris Buffered Saline (TBS), pH 7.4			137 mM NaCl, 5 mM KCl, 491 mM MgCl, 680 mM CaCl, 25.1 mM Tricine
מלאי HSV-1			מלאים עם טיטרים הגבוהים מ-1x109 PFU/mL עובדים בצורה הטובה ביותר
5´-Ethynyl-2´-deoxycytidine (EdC)	Sigma-Aldrich	T511307	המס ב-DMSO להכנת מלאי 40 mM, חלק לאליקוויטות ושמור ב-20 °C-
אינקובטור לתרביות תאים
מแสดง בטיחות ביולוגית
בלוקי חימום			65 °C ו-95 °C