בידוד חלבונים מקומפלקסים של DNA ויראלי-חלבון

תקציר

מקור: .Dembowski, J. A ואחריםטיהור של DNA נגיפי לצורך זיהוי חלבונים נגיפיים ותאיים נלווים. J. Vis. Exp. (2017).

סרטון זה מדגים את בידודם של קומפלקסים של חלבון-DNA ויראלי מגרעיני תאים באמצעות כימיית קליק (click chemistry) וטיהור באמצעות חרוזי מגנט. הפרוטוקול כולל סימון של גנומים ויראליים באמצעות נוקלאוטידים שעברו מודיפיקציה של אלקין, ביוטינילציה באמצעות תגובת קליק, וקישור לחרוזי מגנט מצופים בסטראפטווידין. לאחר שטיפה ואלוציה תרמית, הקומפלקסים המטוהרים נאספים, עוברים הקפאה מהירה ומאוחסנים לצורך אנליזות המשך.

פרוטוקול

1. טהרה של vDNA וחלבונים משויכים

הערה: יש לצנן את כל הבאפפרים והריאגנטים על קרח לפני השימוש, ויש לבצע את כל השלבים על קרח, אלא אם צוין אחרת.

1. איסוף גרעינים. הערה: לפני בידוד הגרעינים, ניתן להשתמש בפורמלהיד כדי ליצור קשרי צלב (crosslink) בין חלבונים ל-DNA. לאחר מכן ניתן להשתמש בתנאי שטיפה מחמירים יותר במהלך טהרת ה-DNA על חרוזיים מצופים בסטרפטאבידין.
   1. החליפו את מצע הגידול ב-20 mL של באפר להוצאת גרעינים (NEB) והדגירו למשך 20 דקות ב-4 °C עם ניעור קל מדי פעם. הגרעינים יהיו גלויים במיקרוסקופ.
   2. גרדו את הגרעינים מהצלחת באמצעות גורד תאים והעבירו לשפופרת קונית של 50 mL. צנטריגו למשך 10 דקות ב-2,50 x g ב-4 °C כדי לשקיע את הגרעינים, והשליכו את העלייה (supernatant).
      הערה: ניתן להשתמש בצביעת Trypan blue כדי לוודא את בידוד הגרעינים מהתאים.
   3. שחררו בעדינות את משקע הגרעינים ב-10 mL של סלק שהוen פוספטים (PBS), העבירו לשפופרת קונית של 15 mL, ושקיעו על ידי צנטריפיגציה למשך 10 דקות ב-2,50 x g ב-4 °C. הסירו את ה-PBS לחלוטין.
      הערה: ניתן להקפיא את הגרעינים, ולהשהות את הפרוטוקול בשלב זה. כדי לעשות זאת, השעיקו בעדינות את משקע הגרעינים ב-500 µL של באפר הקפאה והדגירו את השפופרת באמבט אתנול/קרח יבש. אחסנו גרעינים קפואים ב-80 °C-. לפני השימוש, הפשיר את הגרעינים בטמפרטורת החדר, העבירו במהירות לקרח, הוסיפו 10 mL PBS, נערה בעדינות לערבוב, שקיעו על ידי צנטריפיגציה למשך 10 דקות ב-2,50 x g ב-4 °C, והסירו את ה-PBS לחלוטין. הקפאת גרעינים עלולה להוביל לירידה בניבוי.
2. צימוד קוולנטי של biotin-azide ל-DNA ויראלי או vDNA המסומן ב-5-ethynyl-2′-deoxycytidine (EdC).
   1. השעיקו מחדש את משקע הגרעינים ב-10 mL של תערובת לתגובת קליק [ראו טבלת החומרים] על ידי פיפטינג עדין למעלה ולמטה 5 פעמים עם פיפט של 10 mL.
      הערה: חשוב שהריאגנטים הכלולים בתערובת לתגובת הקליק יתווספו בסדר המצוין.
   2. סובבו למשך שעה אחת ב-4 °C. בזמן הסיבוב, הכינו וקררו את הבאפרים B1, B2 ו-B3 [ראו טבלת החומרים].
   3. שקיעו את הגרעינים על ידי צנטריפיגציה למשך 10 דקות ב-2,50 x g ב-4 °C. הסירו לחלוטין את תערובת תגובת הקליק ושטפו את המשקע על ידי השעיה עדינה ב-10 mL PBS וצנטריפיגציה למשך 10 דקות ב-2,50 x g ב-4 °C.
   4. השעיקו בעדינות את משקע הגרעינים ב-1 mL PBS והעבירו לשפופרת מיקרו-צנטריפוגה של 1.5 mL באמצעות טיפ פיפט רחב. שקיעו את הגרעינים על ידי צנטריפיגציה למשך 10 דקות ב-2,50 x g ב-4 °C. הסירו את ה-PBS לחלוטין והקפיאו במהירות (flash freeze) בחנקן נוזלי.
      הערה: ניתן להשהות את הפרוטוקול בשלב זה, ואת הגרעינים הקפואים ניתן לאחסן ב-80 °C-. הקפאה והפשרה מסייעים לליזיס הבא, לכן מומלץ לבצע הקפאה מהירה לגרעינים גם כאשר ממשיכים לשלב 1.3 באותו היום.
3. ליזיס של גרעינים ופרגמנטציה של DNA.
   1. הפשירו את הגרעינים על קרח והשעיקו ב-50 µL של באפר B1 על ידי פיפטינג למעלה ולמטה. הדגירו על קרח למשך 45 דקות.
   2. בצעו סוניקציה לדגימות 6 פעמים למשך 30 שניות כל אחת באמפליטודה של 40% באמצעות מיקרו-טיפ פרוב של 3 mm. הניחו את הדגימות על קרח למשך 30 שניות בין הפולסים. לאחר הסוניקציה, הדגימות צריכות להיראות שקופות ולא עכורות.
      הערה: יש לבצע אופטימיזציה של תנאי הסוניקציה עבור כל מכשיר סוניקטור בנפרד.
   3. שקיעו את שיירי התאים על ידי צנטריפיגציה ב-14,00 x g למשך 10 דקות ב-4 °C. גודל המשקע צריך להקטן משמעותית. סננו את העלייה דרך מסננת תאים של 10 µM ושמרו את הנוזל שעבר את הסינון.
   4. הוסיפו 50 µL של באפר B2 לעלייה המסוננת. 90 µL מדגימה זו ישמשו בשלב 1.4.2.
   5. קחו אליקוט מכל תנאי לבידוד DNA (50 µL או 1/20 מהנפח) והוסיפו 50 µL של תמיסת 2x sodium dodecyl sulfate (SDS)-bicarb [ראו טבלת החומרים]. המשיכו לפרוטוקול בידוד ה-DNA.
   6. קחו אליקוט מכל תנאי עבור חלבון קלט (50 µL או 1/20 מהנפח) והוסיפו 50 µL של 2x Laemmli sample buffer, הקפיאו בחנקן נוזלי ואחסנו ב-80 °C-.
4. קישור DNA מביוטינילי לחרוזיים מצופים בסטרפטאבידין.
   1. הכינו חרוזיים מגנטיים של Streptavidin T1 על ידי העברת 30 µL של תרחיף חרוזיים לשפופרת מיקרו-צנטריפוגה של 1.5 mL. הכינו שפופרת חרוזיים אחת לכל דגימה. שטפו את החרוזיים 3 פעמים עם 1 mL באפר B2 על ידי וורטקס להשעיה, שימוש במגנט להפרדת החרוזיים, ושאיבה של באפר השטיפה.
      הערה: תנאי קישור אופטימליים מובילים לניבוי מקסימלי ולקישור רקע מינימלי. נקבע ניסיונית כילחרוזיים מגנטיים של Streptavidin T1 יש קיבולת קישור גדולה משמעותית מאשר לחרוזי אגרוז, וכן מאשר חרוזי סטרפטאבידין אחרים, וקישור רקע נמוך יותר מאשר לחרוזי Streptavidin C1 (איור 1A).
   2. הוסיפו 90 µL מהדגימה משלב 1.3.4. לחרוזיים השטופים וסובבו למשך הלילה ב-4 °C.
      הערה: אין לבצע וורטקס לחרוזיים לאחר הוספת הדגימה אליהם.
      הערה: אם מבודדות כמויות משמעותיות של DNA או חלבון בביקורת השלילית ללא סימון, ניתן לקצר שלב זה מהלילה ל-4 שעות כדי להפחית את קישור הרקע.
5. שטיפת חרוזיים ואלוציה של vDNA וחלבונים משוירים.
   הערה: מומלץ להשתמש בטיפים עם פילטר לשלבים הנותרים.
   1. הניחו את הדגימות במעמד מגנטי לשפופרות מיקרו-צנטריפוגה, הסירו את העלייה, השעיקו בעדינות ב-1 mL באפר B2, וסובבו ב-4 °C למשך 5 דקות.
   2. חזרו על שלב 1.5.1 שלוש פעמים.
   3. הניחו את הדגימות במעמד מגנטי לשפופרות מיקרו-צנטריפוגה, הסירו את העלייה, השעיקו בעדינות ב-1 mL באפר B3, וסובבו ב-4 °C למשך 5 דקות.
   4. העבירו 10 µL מתערובת החרוזיים (1/10 מהנפח) לשפופרת חדשה לבידוד DNA קשור. הניחו שפופרת זו על המגנט, הסירו את העלייה, השעיקו את החרוזיים ב-10 µL של 1x sodium dodecyl sulfate או תמיסת SDS-bicarb, והמשיכו לפרוטוקול בידוד ה-DNA.
   5. הניחו את השפופרת המכילה את 90 µL הנותרים מתערובת החרוזיים משלב 1.5.3. על המגנט, הסירו את העלייה, והשעיקו את החרוזיים ב-50 µL של 2x Laemmli sample buffer כדי לבצע אלוציה לחלבון ול კომპלקסים של DNA-חלבון.
   6. הרתיחו את הדגימות ב-95 °C למשך 15 דקות, בצעו וורטקס, סובבו במהירות במיקרו-צנטריפוגה, והשתמשו במגנט. העבירו את האלוואט לשפופרת חדשה, הקפיאו במהירות ואחסנו ב-80 °C-.
      הערה: השתמשו בכיסויים מאובטחים כדי להבטיח שהשפופרות לא יקפצו בזמן ההרתח Lifting.
      הערה: ניתן להשהות את הפרוטוקול בשלב זה, ואת הדגימות ניתן לאחסן ב-80 °C- למשך מספר שבועות.
   7. נתחו את דגימות החלבון על ידי צביעת Coomassie Blue, Western blotting או ספקטרומטריית מסה בשיטות סטנדרטיות. תוצאות מייצגות מוצגות באיורים 1 ו- 2.
      הערה: כדי לקבוע אם ניבוי החלבון מספיק לספקטרומטריית מסה, נעשה שימוש ב-7.5 µL מכל דגימה לניתוח על ידי צביעת Coomassie Blue וב-7.5 µL ל-western blotting של חלבון מייצג המשויך לגנום ויראלי (ICP4, ICP8 או UL42). נפח זהה של ליזאטים משלב 1.3.6. מורץ לצדם כדי לבקר את רמות חלבון הקלט. שאר הדגימה (35 µL) מנותחת לאחר מכן על ידי ספקטרומטריית מסה.

תוצאות

איור 1: תוצאות מייצגות של ניקוי חלבונים. (A) השוואה של תנובת החלבון כאשר שלבי הניקוי בוצעו באמצעות מספר סוגים שונים של חרוצים מצופים בסטרפטאווידין. ההדבקה בוצעה בנוכחות EdC (+) להשוואת תנובת החלבון או בהיעדר EdC (-) להשוואת קישור הרקע. ההדבקות והסימון ב-EdC בוצעו, וקומפלקסי DNA-חלבון נקיים באמצעות כמויות דומות של סוגים שונים של חרוצים מצופים בסטרפטאווידין. פאנל עליון: השוואת תנובת החלבון לאחר ניקוי על חרוצי אגרוז מצופים בסטרפטאווידין או Streptavidin M-280. פאנל תחתון: השוואת תנובת החלבון לאחר ניקוי על Streptavidin M-270, M-280, Streptavidin C1, או Streptavidin T1. Western blotting בוצע עם נוגדן נגד החלבון הנגיפי ICP4. ICP4 מנוקה מוצג בנתיב הראשון לצורך השוואה. חשיפה ממושכת יותר של הפאנל התחתון הייתה נדרשת כדי לצפות בעוצמה דומה של ICP4 בנתיב 280 כפי שמופיע בפאנל העליון. (B) מוצגות תוצאות מייצגות של ניקוי חלבונים כפונקציה של זמן הסימון ב-EdC. ההדבקות והסימון ב-EdC בוצעו, וקומפלקסי DNA-חלבון נקיים באמצעות חרוצי Streptavidin T1. סימון ב-EdC בוצע למשך 0, 20, 40, או 60 min, ומוצגות תוצאות של צביעת Coomassie Blue (למעלה) ו-western blotting (למטה). Western blotting בוצע עם נוגדים ספציפיים ל-ICP4, UL42, או GAPDH. דגימת האלוציאה נלקחה משלב 1.5.5. והליסאט משלב 1.3.6. החץ מצביע על סטרפטאווידין, בעוד ש-L מציין סולם חלבונים.

איור 2: דוגמאות לדרכים שונות להצגת נתוני פרוטאומיקה. (A) תרשימי עוגה המסכמים את החלבונים שזוהו באמצעות ספקטרומטריית מסות של אלוציות חלבון הקשורות לגנומים ויראליים שטוהרו ב-6 hpi. הערכים מציינים את מספר החלבונים שזוהו עבור כל קטגוריה תפקודית. T מציין את המספר הכולל של החלבונים שזוהו. הצבעים מציינים את הקטגוריות הבאות: סגול - עיבוד RNA, אדום - שעתוק, ירוק - ארגון מחדש של כרומטין, כתום - שכפול DNA, צהוב - מעבר גרעיני, טורקיז - שלד התא, כחול כהה - חלבונים מבניים של HSV, ואפור - אחר/לא ידוע. (B) דיאגרמות וון המתארות את החפיפה של חלבונים שזוהו כקשורים לגנומים ויראליים ב-6, 8 או 12 hpi. (C) מפת STRING המתארת חלבונים שהועשרו בנקודות השכפול הוויראליות לאחר דופק EdC של 5 דקות. חלבונים אנושיים שהועשרו פי 5 בהשוואה לבקרת השלילה ללא סימון מוצגים במפת האינטראקציה התפקודית, אשר הופקה באמצעות STRING עם הגדרות נתונים להצגת אינטראקציות בעלות מהימנות גבוהה בלבד. שמות גנים שימשו למיפוי האינטראקציות. עיגולים מציינים חלבונים הפועלים באותו תהליך ביולוגי.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה

שם	חברה	מספר קטלוג	הערות
תאי MRC-5	ATCC	CCL-171
סרום עגל עוברי (FBS)	Gibco	26140-179
מצע דולבקו של איגל המשופר (DMEM)	Gibco	12800-082	הושלם ב-10% FBS, 2 mM L-glutamine, 12 mM (עבור גידול בבקבוקים) או 30 mM (עבור גידול בצלחות) sodium-bicarbonate
60 סמ"ק² צלחת לתרבית רקמה	Thermo Fisher Scientific	166508
תמיסת Tris Buffered Saline (TBS), pH 7.4			137 mM NaCl, 5 mM KCl, 491 mM MgCl, 680 mM CaCl, 25.1 mM Tricine
מלאי HSV-1			מלאים בעלי טיטרים גבוהים מ-1x10⁹ יחידות PFU/mL הן היעילות ביותר
עמודת Sephadex G-25 (עמודת הסמכה PD-10)	GE Healthcare	17085101
דימתיל סולפוקסיד (DMSO)	Fisher Scientific	D128-1
5´-Ethynyl-2´-deoxycytidine (EdC)	Sigma-Aldrich	T51307	המס ב-DMSO להכנת תמיסת אם בריכוז 40 mM, חלק לאליקוטים ושמור בטמפרטורה של -20 °C
2´-דאוקסיציטידין (deoxyC)	Sigma-Aldrich	D3897	המס במים להכנת תמיסת מלאי בריכוז 40 mM, חלק למקבצים (aliquots) ואחסן ב-20 °C
בופר להפקה גרעינית (NEB)			הכינו תמיסה טרייה (20 mM Hepes pH 7.2, 50 mM NaCl, 3 mM MgCl₂, 300 mM סוכרוז, 0.5% Igepal)
גורד תאים	זכוכית Bellco	7731-22000	יש לעקר באוטוקלב לפני השימוש
תמיסת Trypan blue	Sigma-Aldrich	T8154
PBS, pH 7.2 (10x)			1.37 M NaCl, 27 mM KCl, 100 mM Na₂HPO₄, 18 mM KH₂PO₄ (יש לדל לריכוז 1x במים סטריליים לפני השימוש)
נחושת (II) סולפיה פנטהידרט (CuSO₄·5 שעות₂O)	Fisher Scientific	C489	הכינו תמיסת מלאי בריכוז 10 mM ואחסנו ב- 4 °C עד לחודש אחד
(+) נתרב L-אסקורבט	Sigma-Aldrich	A4034	הכינו תמיסת מקור (stock) בריכוז של 10 mM באופן טרי, ואחסנו על קרח עד לשימוש
ביוטין-אזיד	Invitrogen	B10184	הכינו תמיסת מלאי בריכוז 10 mM ב-DMSO, חלק למטריצות (aliquots) ואחסנו בטמפרטורה של -20 °C עד שנה אחת
תערובת לתגובת קליק (Click Reaction)			יש להכין מיד לפני השימוש על ידי הוספת הרכיבים בסדר המצוין (10 מ"ל: 8.8 מ"ל 1x PBS, 20 מ"ל 10 mM CuSO₄, 25 מ"ל 10 mM ביוטין אזיד, 1 מ"ל 10 mM נתרב ascorbate)
תערובת מעכבי פרוטאז מלאה (Complete Protease Inhibitor Cocktail)	Roche	11697498001	המסס ב-1 מ"ל מים להכנת תמיסת מלאי בריכוז 50x, ניתן לאחסן ב- 4 °C עד שבוע אחד, או הוספה ישירה של גלולה אחת ל-50 מ"ל בופר
בופר הקפאה			הכינו תמיסה טרייה (7 מ"ל גליצריול 10%, 3 מ"ל NEB, 200 μL מעכב פרוטאז 50x (protease inhibitor))
בופר B1			הכינו תמיסה טרייה (25 mM NaCl, 2 mM EDTA, 50 mM Tris-HCl pH 8, 1% Igepal, 1x מעכב פרוטאז)
בופר B2			הכינו תמיסה טרייה (150 mM NaCl, 2 mM EDTA, 50 mM Tris-HCl pH 8, 0.5% Igepal, מעכב פרוטאז 1x)
בופר B3			הכינו תמיסה טרייה (150 mM NaCl, 2 mM EDTA, 50 mM Tris-HCl pH 8, מעכב פרוטאזה 1x)
מעבד אולטרסאוני Vibra Cell Ultra Sonic Processer המצויד בראש מיקרו-טיפ (microtip) בקוטר 3 מ"מ	Sonics	VCX 130
מסננת תאים	Falcon	352360
Dynabeads MyOne Streptavidin T1	Life Technologies	65601
מגנט DynaMag-2	Life Technologies	12321D
רוטטור למבחנות קטנות (Mini-Tube Rotator)	Fisher Scientific	260750F
תמיסת דגימה Laemmli בריכוז 2x			ערבבו 40 מ"ג SDS, 2 מ"ל גליצרין 100%, 1.25 מ"ל Tris בריכוז 1 M (pH 6.8), ו-10 מ"ג ברומופנול כחול (bromophenol blue) ב-8 מ"ל מים. אחסנו ב- 4 °C עד 6 חודשים. לפני השימוש, יש להוסיף DTT בריכוז 1 M עד לריכוז סופי של 20 mM.
נעילת מכסים לשפופרות 1.5 מ"ל	Fisher Scientific	NC9679153
ריאגנטים סטנדרטיים ל-western blotting
ערכה לצביעה ב-NOVEX Colloidal Blue	Invitrogen	LC6025
צלחת תרבית רקמה בעלת 12 בארות	Corning	3513
לוחיות כיסוי	Fisher Scientific	12-545-100	סטריליזציה באוטוקלאב לפני השימוש
שקופיות למיקרוסקופ	Fisher Scientific	12-552-5
16% פראפורמדהיד	Electron Microscopy Sciences	15710	יש לדלל ל-3.7% ב-1x PBS לפני השימוש
אלבומין משרת בקר (BSA)	Fisher Scientific	BP1605	הכינו תמיסה בריכוז של 3% ב-1x PBS
בופר חדירה (0.5% Triton-X 10)	Sigma-Aldrich	T8787	הכינו 0.5% Triton-X 10 ב-1x PBS
תערובת לתגובת קליק (Click) - ערכה לדימוי Click-iT EdU Alexa Fluor 488	Molecular Probes	C10337	יש להכין על פי פרוטוקול היצרן
תמיסת SDS-bicarb בריכוז 2x			2% SDS, 20 mM NaHCO₃₃
Tris EDTA (TE) בריכוז 10x, pH 8.0			10 mM Tris, 10 mM EDTA (יש לדלל לריכוז 1x לפני השימוש)
מיקרו-צנטריפוגה לשפרורות של 1.5 מ"ל
צנטריפוגה שולחנית למבחנות של 15 ו-50 מ"ל
אינקובטור לתרביות תאים
מבת בטיחות ביולוגית
בלוקי חימום			65 °C ו- 95 °C