מכשיר מצופה סיליקון שהודפס בתלת מימד למודל זיהום בדרכי השתן הקשור לצנתר

תקציר

מקור:
אושן א. קלארק¹, רומי א. דופ¹, טום האסל¹, ג'ואן ל. פותרגיל¹, דניאל ר. ניל<sup>2

1</sup>אוניברסיטת ליברפול, ² אוניברסיטת דנדי

סרטון זה מדגים את השימוש במכשיר מודפס בתלת מימד ומצופה סיליקון המחקה את המשטח הפנימי של צנתרי שתן כדי לדמות זיהום בדרכי השתן הקשור לצנתר.

פרוטוקול

כל ההליכים הכרוכים באיסוף דגימות בוצעו בהתאם להנחיות ה-IRB של המכון.

1. ייצור תוסף של דגמי Flexipeg

1. הדפס יתדות (נדרשות 24 יתדות לכל מכסה יתד) ומכסי יתדות בשרף יציב בטמפרטורה גבוהה באמצעות סטריאוליתוגרפיה (גובה שכבה של 100 מיקרומטר).
   הערה: שרף יציב בטמפרטורה גבוהה משמש ליתדות, וניתן לעקר מכסי יתד לפני הניסוי.
2. הדפס בתלת מימד הן את רכיבי התבנית והן את חלקי מתלה המבחנה באמצעות דוגמנות תצהיר התמזגות (FDM) עם מילוי של 60%.
   הערה: כל שרף עמיד מתאים ל-FDM, שכן ניתן לעקר תבניות ומתלי מבחנה באתנול ואינם דורשים יציבות בטמפרטורות גבוהות.
3. ודא שרכיבי הדגם הודפסו כהלכה והסר שאריות עודפות מתהליך ההדפסה באמצעות 70% אתנול.
4. הרכיבו את תבנית מחצלת הסיליקון כפי שמוצג באיור 1, והחזיקו את הצדדים במקומם בעזרת סרט במידת הצורך.

2. הכנת דגם Flexipeg

1. הכנת מחצלת סיליקון
   1. שקלו 18 גרם של בסיס סיליקון (בסיס 10:1 לזרז פולידימתילסילוקסן (PDMS), תרופת עיבוי) לכוס וערבבו בעדינות 2 גרם זרז עד לקבלת תערובת אחידה.
      הערה: הימנע מערבוב יתר של תערובת הסיליקון כדי למנוע היווצרות בועות בתוך התבנית.
   2. יוצקים את תערובת הסיליקון המשולבת לתבנית המודפסת FDM, מנגבים את כל תערובת הסיליקון העודפת מדפנות התבנית ומהחלק העליון של התבנית. יש לאפשר להתרפא למשך הלילה (מינימום 18 שעות) בטמפרטורת החדר (RT).
   3. הסר את המחצלת מהתבנית, וחתוך את כל עודפי הסיליקון מהצדדים. ודא שהמחצלת מתאימה למכסה היתד, כפי שמוצג באיור 1.
2. ציפוי יתד
   1. הכנס את היתדות למחצלת סיליקון (24 יתדות למזרן) והדק את המחצלת למכסה היתד או למגש פלסטיק במידות דומות למחצלת באמצעות סרט.
   2. שקלו 27 גרם בסיס סיליקון למגש פלסטיק רדוד (בערך באותם מידות כמו צלחת של 96 בארות) וערבבו היטב פנימה 3 גרם זרז עד לקבלת תערובת אחידה.
   3. הפוך את מכסי היתדות כך שהיתדות פונות כלפי מטה, וטבל מיד את היתדות בתערובת הסיליקון. הפוך את מכסה היתדות ואפשר לעודפי הסיליקון לטפטף במורד היתדות וליתדות להתרפא למשך הלילה בטמפרטורת החדר.
      הערה: סיליקון לריפוי מהיר (6-8 שעות ריפוי מלא; זמן עבודה של 40-60 דקות) ימשיך לטפטף/לזרום לפני הריפוי; לכן, אין חובה לצפות את כל היתד ב-PDMS בעת הטבילה, שכן כל עודף יצפה את שאר היתד במהלך הריפוי.
   4. לאחר הריפוי, חזור על שלבים 2.2.2 עד 2.2.3. עד שהיתדות צופו שלוש פעמים ב-PDMS. ודא ששכבת הציפוי הראשונה נרפאה לחלוטין לפני שתמשיך לשלב הציפוי השני.
      הערה: ציפויי יתד סופיים צריכים להיות בעובי של <2 מ"מ ללא פגמים גלויים. אם הסיליקון נשאר דביק לאחר דגירה של לילה ב-RT, אפשר לו להתרפא במשך 24 שעות, והשליך ציפויים אם יתדות עדיין דביקות למגע.
   5. בעזרת אזמל סטרילי, חתוך סביב בסיס היתדות המצופות סיליקון (קרוב ככל האפשר לתחתית) כדי להסיר את היתדות ממערך הציפוי.
      הערה: יש לחזור על תהליך זה עד להכנת המספר הרצוי של יתדות ומחצלות סיליקון. ניתן להשתמש בעודפי PDMS המשמשים בתהליך ציפוי היתד ליציקת מחצלות סיליקון חדשות לפני הריפוי.
3. הגדרת דגם
   1. הכנס יתדות מצופות לתוך שטיח הסיליקון ואבטח את המחצלת במכסה היתד, כפי שמוצג באיור 1.
   2. כסו את הצד התחתון של מכסה היתד/שטיח הסיליקון (המחובר לבסיס היתד) בנייר דבק הניתן לחיטוי כדי לשמור על היתדות במקומן. הנח את מערך מכסה היתד בשקית אטומה הניתנת לחיטוי, וחיטוי חיטוי לפני השימוש.
      הערה: יתדות במכסה היתד יתאימו לצלחת של 96 בארות בכיוון יחיד אחד. לאחר הדבקת הגדרת היתד, בדוק את יישור היתדות בצלחת רזרבית של 96 בארות ותייג את סרט החיטוי בהתאם לכיוון המכסה הנכון.

3. חיסון דגמים

1. הכנת תרבית חיידקים
   1. הכן תרביות לילה של חיידקים מבודדים שנבדקו על ידי השעיית לולאה של מושבות חיידקים הגדלות על מצע מוצק ב-10 מ"ל של מרק לוריא-ברטאני (LB). דגירה למשך הלילה (18 שעות) ב-37 מעלות צלזיוס עם תסיסה.
      הערה: לפחות שלושה שכפולים ביולוגיים מומלצים לשימוש במודל הביופילם של Flexipeg.
   2. לנרמל תרביות ל-OD_{600 ננומטר}של 0.1 (כ-10⁸ יחידות יוצרות מושבה (CFU)/מ"ל לאחר דילול צלחת) בנפח סופי של 1 מ"ל של מי מלח חוצץ פוספט (PBS).
2. הגדרת מיקרו-פלטות וחיסון
   1. יש לצרוך 135 מיקרוליטר של שתן אנושי מאוגד (PHU) לכל באר בבדיקה בצלחת של 96 בארות בהתאם לפריסת הצלחת באיור 1 (8). כל באר מייצגת שכפול טכני אחד (נדרשים מינימום n = 3 שכפולים טכניים לכל שכפול ביולוגי).
      הערה: ניתן להשתמש באמצעי שתן מלאכותי (AUM) במקום PHU אם המשתמש מעוניין בכך.
   2. חסנו כל באר בבדיקה ב-15 מיקרוליטר של תרבית הלילה המנורמלת, וכתוצאה מכך נפח באר סופי של 150 מיקרוליטר. שמור לפחות 100 מיקרוליטר של תרבית לילה מנורמלת לדילולים סדרתיים כדי לאמת את ה-CFU/מ"ל של החיסון.
   3. הכן בקרות שליליות על ידי ציטוט של 150 מיקרוליטר של PHU סטרילי רק לבארות רלוונטיות.
   4. לאחר הגדרת המיקרו-פלטה, הכנס את היתדות לבארות שלהן (כפי שנקבע לפני עיקור חיטוי של יתדות), וודא שמכסה היתד צמוד למשטח הצלחת. מכסים את מכסה היתד במכסה המיקרופלייט, ומחזיקים אותו במקומו עם סרט חיטוי במידת הצורך.
   5. יש להניח את דגמי היתד באמבטיה/שקית פלסטיק אטומה עם מודעהamp גליל כחול למניעת אידוי, ולדגור באופן סטטי למשך 24 שעות בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס.
3. אימות חיסון
   1. יש לשים 180 מיקרוליטר של PBS לשורות 2-6 של העמודה הראשונה של מיקרו-צלחת של 96 בארות ולהוסיף את 100 מיקרוליטר השמור של תרבית לילה מנורמלת לבאר הראשונה.
   2. הסר 20 מיקרוליטר מתרבית הלילה המנורמלת מהבאר הראשונה והכניס לבאר השנייה, תוך פיפטינג בעדינות למעלה ולמטה כדי לערבב.
   3. חזור על שלב 3.3.2 עד שהחיסון הראשוני מדולל לבאר הסופית (1 × 10⁵).
   4. צלחת 10 מיקרוליטר כתמים של כל דילול על מדיה מוצקה מתאימה בשלוש עותקים. יש לדגור באופן סטטי למשך הלילה בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס.
   5. לאחר הדגירה, ספרו את מספר המושבות בכל נקודה כדי לחשב את ה-CFU/mL בפועל של החיסון.

4. כימות ביופילם

1. עיבוד יתד
   1. לאחר הדגירה, הסר את דגם היתד מהמיקרו-פלטה, והפוך אותו מתחת ללהבה או בתוך ארון בטיחות מיקרוביאלי (יתדות פונות כלפי מעלה). השלך מיקרו-פלטות.
   2. העבירו את מכסה היתד למיקרו-פלטה טרייה המכילה 180 מיקרוליטר של PBS סטרילי כדי להסיר תאים לא דבוקים. חזור על הפעולה פעמיים ב-PBS טרי בסך הכל שלושה שלבי כביסה.
      הערה: כדי למנוע נזק לביופילמים הקשורים למשטח, הימנע מהפרעה ליתדות בעת הסרת מכסה היתד מכל מיקרו-צלחת (כלומר, נגיעה בקצוות הבאר).
2. ספירת CFU/mL (משויכת לביופילם)
   1. עבודה אספטית מתחת ללהבה או בארון בטיחות מיקרוביולוגי, הגדר את מתלה הצינורות (מיוצר בשלב 1.2.) עם מבחנות זכוכית סטרילית כפי שמוצג באיור 1, והצמד את החלק העליון של המתלה המתאים למכסה היתד.
   2. באופן אספטי, יש להכניס 600 מיקרוליטר של PBS סטרילי לכל מבחנה.
   3. הנח את מכסה היתד לתוך המתלה, עם יתדות בקו אחד עם הצינורות במתלה. הסר כל סרט חיטוי על מכסה היתד.
   4. בעזרת מלקחיים סטריליים, דחף את היתדות דרך מכסה היתד ולתוך המבחנות המתאימות המיושרות למטה.
   5. החזר את מכסי הצינור למקומו, וסובב כל צינור למשך 60 שניות כדי לפרק את התאים הקשורים לביופילם ממשטח היתד.
   6. הסר 100 מיקרוליטר מכל צינור ודלל סדרתי כמתואר קודם לכן בשלב 3.3 ב-PBS סטרילי.
   7. שימוש בצלחת פיפטה סרולוגית 10 מיקרוליטר נקודות מכל דילול על מצע מוצק מתאים, ודגירה סטטית ב-37 מעלות צלזיוס למשך הלילה.
   8. לאחר הדגירה, ספרו את מספר המושבות על כל צלחת דילול והשתמשו בה כדי לחשב את ה-CFU/mL.
3. מכתים סגול קריסטל
   1. יש להכניס 180 מיקרוליטר של 0.1% (w/v) סגול קריסטל (במים סטריליים) לתוך 24 הבארות שנבדקו של מיקרו-פלטה של 96 בארות.
   2. הכנס את דגם היתד השטוף (יתדות ומכסה יתד) לבארות המתאימות של המיקרופלייט. דוגרים באופן סטטי בטמפרטורת החדר למשך 20 דקות.
   3. לאחר הדגירה, הסר את דגם היתד מהמיקרופלייט והשליך את המיקרופלייט.
   4. באמבטיה בגודל מתאים, שטפו את כל היתד הקבוע במי ברז תוך כדי ערבוב עדין. חזור על הפעולה שלוש פעמים.
   5. הפוך את דגם היתדות ואפשר ליתדות להתייבש לחלוטין ב-RT.
   6. יש לשים 180 מיקרוליטר של 30% חומצה אצטית לתוך מיקרופלייט טרי של 96 בארות ולהכניס את דגם היתד המיובש לבארות המתאימות. דגירה ב- RT למשך 30 דקות.
   7. הסר את דגם היתד מהמיקרופלייט וקרא OD_540nm של הבארות המוכתמות באמצעות קורא מיקרו-פלטות או ספקטרופוטומטר.
   8. כדי לחשב היווצרות ביופילם על יתדות, ממוצע ה-OD_{540 ננומטר} של יתדות הבקרה השליליות המוכתמות והחסר מהממוצע של יתדות הבדיקה.

תוצאות

איור 1: ייצוג סכמטי של מערך מודל Flexipeg. (1) פלקסיפג יחיד, מצופה בפולידימתילסילוקסן (PDMS) כדי לשכפל את משטח צנתר השתן ליצירת ביופילם. (2) מכשיר הביופילם של Flexipeg, המורכב מ- (3) מחצלת הסיליקון המחזיקה יתדות בודדות במקומם ו- (4) המכסה המ...

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה

שם	חברה	מספר קטלוג	הערות
מיקרופלטות 96 באר	גריינר	650161	תחתית בצורת U/עגולה.
חומצה אצטית	SLS	695092-2.5LSIG	≥ 99.7% מגיב ACS.
סגול קריסטל	מרק	ברקוד 61135-25G
יתד בודד	בתוך החברה	רכיבי Flexipeg יודפסו בתלת מימד	ייצור תוסף באמצעות שרף יציב בטמפרטורה גבוהה (דרושים 24 יתדות לכל דגם Flexipeg). מיוצר באמצעות שרף בטמפרטורה גבוהה של Formlabs על ידי Protolabs (NL).
מרק לוריא-ברטאני (LB)	ניאוגן	NCM0088B	מרק LB (מילר).
מכסה שמתאים לצלחת 96 באר	בתוך החברה	רכיבי Flexipeg יודפסו בתלת מימד	ייצור תוסף באמצעות שרף יציב בטמפרטורה גבוהה.
תבנית להכנת מחצלת סיליקון	בתוך החברה	רכיבי Flexipeg יודפסו בתלת מימד	ייצור תוסף מכל חומר עמיד. מיוצר באמצעות שרף אב טיפוס ABS על ידי Protolabs (NL).
תבנית להכנת צד מחצלת סיליקון	בתוך החברה	רכיבי Flexipeg יודפסו בתלת מימד	ייצור תוסף מכל חומר עמיד.
מי מלח עם חוצץ פוספט	מרק	P4417-50TAB
שתן אנושי מצטבר	-	-	נאסף מתורמים בריאים לאחר אישור אתי של ועדת האתיקה המרכזית של המחקר באוניברסיטה.
מתלה לצינורות זכוכית	בתוך החברה	רכיבי Flexipeg יודפסו בתלת מימד	ייצור תוסף מכל חומר עמיד.
סיליקון (PDMS)	MB פיברגלס	GP3481-F	Polycraft לשימוש כללי RTV עיבוי לרפא עובש ייצור גומי סיליקון.
חלק עליון שמתאים למכסה היתד	בתוך החברה	רכיבי Flexipeg יודפסו בתלת מימד	ייצור תוסף באמצעות שרף יציב בטמפרטורה גבוהה.
צנתרי פולי	גרייט בר הלת'קר בריטניה בע"מ		14 ערוצים, 100% סיליקון