טיהור של וקטורים אדנו-ויראליים המכילים גנום באמצעות צסיום כלוריד

תקציר

מקור: Ehrke-Schulz, E., ואחריםשיבוט וייצור בקנה מידה גדול של וקטורים אדנו-ויראליים בעלי קיבולת גבוהה המבוססים על אדנו-וירוס אנושי מסוג 5. J. Vis. Exp. (2016)

סרטון זה מדגים את טהרתם של וקטורים אדנו-ויראליים בעלי קיבולת גבוהה באמצעות אולטרסנטריפוגציה במדרג צסיום כלוריד, המאפשרת הפרדה של ויריונים המכילים גנום לצורך יישומים בהעברת גנים, אפיון וקטורים ומחקרים טיפוליים פרה-קליניים

פרוטוקול

1. טיהור ודיאליזה של HCAdV (וקטורים אדנו-ויראליים בקיבולת גבוהה)
   1. כדי להכין ליזט ויראלי עבור מדרגי צסיום כלוריד (CsCl), הקפיאו את תגלי הוירוס-תאים בחנקן נוזלי והפשירהו באמבט מים ב-37 °C מספר 4 פעמים.
   2. סובבו את הליזט הוויראלי ב-500 x g למשך 8 דקות ב-RT (טמפרטורת החדר) ואספו את עליון הנוזל (supernatant) המכיל את ה-HCAdV (וקטורים אדנו-ויראליים בקיבולת גבוהה).
   3. עבור אולטרה-צנטריפוגציה, הכינו תמיסות CsCl באופן הבא. שקלו בהתאמה 37.5 g (עבור 1.5 g/cm³), 33.5 g (עבור 1.35 g/cm³), ו-31.25 g (עבור 1.25 g/cm³) של אבקת CsCl, והשלימו עם dH₂O עד לנפח של 25 ml.
      1. ערבבו עד שהתמיסה תהיה צלולה וסננו את התמיסות בסינון סטרילי. לבסוף, הסירו 1 ml מכל תמיסה ושקלו אותה במאזניים מדויקים כדי לבדוק אם הצפיפות נכונה. 1 ml אמור לשקול בהתאמה 1.5 g, 1.35 g, ו-1.25 g.
      2. אם הצפיפות גבוהה מדי, התאימו אותה על ידי הוספה מדורגת של נפחים קטנים (µl) של dH₂O סטרילי. לאחר הוספת dH₂O, מדדו שוב את הצפיפות. במידת הצורך, הוסיפו dH₂O נוסף.
      3. חזרו על הפעולה עד שהצפיפות תהיה נכונה. אם הצפיפות נמוכה מדי, התאימו אותה על ידי הוספת כמות קטנה של אבקת CsCl. סננו שוב בסינון סטרילי ובדקו את הצפיפות. אם הצפיפות גבוהה מדי, התאימו אותה על ידי הוספת dH₂O כפי שתואר קודם לכן. אם הצפיפות עדיין נמוכה מדי, הוסיפו עוד CsCl, סננו שוב בסינון סטרילי ובדקו את הצפיפות. חזרו על הפעולה עד שהצפיפות תהיה נכונה.
   4. הכינו מדרגי CsCl מדורגים ב-6 מבחנות אולטרה-צנטריפוגה שקופות. העבירו בזהירות ובאיטיות בעזרת פיפט תמיסות CsCl למבחנות לפי הסדר הבא: 0.5 ml של תמיסת CsCl בריכוז 1.5 g/cm³, 3 ml של תמיסת CsCl בריכוז 1.35 g/cm³, ו-3.5 ml של תמיסת CsCl בריכוז 1.25 g/cm³ (איור 1C).
   5. הוסיפו מעל שכבת ה-1.25 g/cm³ CsCl כ-4.5 ml של עליון וקטורים מזוקק משלב 1.2. סובבו את המדרגים באולטרה-צנטריפוגה באמצעות רוטור מסוג swing-out (SW-41) ב-12 °C למשך 2 שעות לפחות ב-226,000 x g (35,000 rpm) עם האצה והאטה איטיות כדי להפריד חלקיקים ויראליים המכילים גנום של HCAdV מחלקיקים ריקים ומשאריות תאים.
      הערה: בתנאים אופטימליים, נוצר פס מפוזר של שאריות תאים בחלק העליון של המבחנות. מתחתיו, ניתן להבחין בשני פסים לבנים. הפס העליון מכיל חלקיקים ריקים, בעוד שהפס התחתון מקביל ל-HCAdV (איורים 1C ו-2A).
   6. הסירו בזהירות את השכבות של שאריות התאים והחלקיקים הריקים, אספו 1 ml מהפסים התחתונים מכל מבחנה והעבירו את הוירוס באמצעות טיפ פיפט נקי למבחנה סטרילית של 50 ml. הוסיפו עד 24 ml של תמיסת CsCl בריכוז 1.35 g/cm³ לחלקיקי הוירוס שנאספו וערבבו בזהירות.
   7. מלאו מבחנות צנטריפוגה עד למעלה עם תמיסת CsCl-וירוס בריכוז 1.35 g/cm³ וסובבו O/N (במהלך הלילה) (18-20 שעות) ב-226,000 x g (35,000 rpm) ב-12 °C באולטרה-צנטריפוגה באמצעות רוטור מסוג swing-out (SW-41) עם האצה והאטה איטיות.
   8. אספו את ה-HCAdV הנמצא בפס התחתון הבולט. כיוון שפס עליון פוטנציאלי מכיל חלקיקים ריקים, הסירו את השכבות העליונות מהחלק העליון באמצעות פיפט (ראו איורים 1C ו-2B). לאחר מכן, הוציאו את הפס התחתון באמצעות פיפט.
   9. בצעו דיאליזה לחלקיקי הוירוס שנאספו לצורך החלפת באפר.
      1. גזרו רצועה של צינור דיאליזה (MWCO: 50,000) באורך של כ-8 cm, שטפו אותה ב-dH₂O סטרילי מספר 3 פעמים. לאחר מכן, סגרו צד אחד של צינור הדיאליזה עם תפס פלסטיק והעבירו את הוירוס שנאסף משלב 5.8 לתוך הצינור באמצעות פיפט של 1 ml. הימנעו מבועות אוויר בתוך הצינור וסגרו אותו בצד השני עם תפס פלסטיק לסגירת דיאליזה.
      2. בצעו דיאליזה ב-1 L של באפר דיאליזה (10 mM Tris-HCl (pH 7.5), 10% גליצרין, ו-1 mM MgCl₂ (מגנזיום כלוריד) ב-H₂O דה-יוני) למשך 2 שעות ב-4 °C עם ערבוב איטי. החליפו את באפר הדיאליזה ב-2 L של באפר דיאליזה ובצעו דיאליזה O/N ב-4 °C עם ערבוב איטי. לחלופין, השתמשו בבאפר סוכרוז (140 mM NaCl (נתרן כלוריד), 5 mM Na₂HPO₄.2H₂O (די-נתרן מימן פוספט), 1.5 mM KH₂PO₄ (אשלגן מימן פוספט), ו-730 mM סוכרוז, pH 7.8).
      3. אספו את חלקיקי הוירוס שעברו דיאליזה משלב 1.9.2 באמצעות פיפט של 1 ml. הכינו מספר אליקוטים בנפחים קטנים רצויים (25-100 µl) ואחסנו את הוירוס המטוהה ב-80 °C-.

תוצאות

איור 1. תוצאים מייצגים של הליך השבט והשחרור של הגנום של HCAdV (וקטורים אדנו-ויראליים בעלי קיבולת גבוהה) מתוך pAdVFTC. (A) שחרור של קסטת ביטוי של הגן המבוקש (GOI) מתוך pHM5 על ידי עיכול עם PI-SceI ו-I-CeuI. (B) קסטת ביטוי של GOI מטהרת ו-pAdVFTC מטהר ודה-פוספוריליר, שעובדו בעיכול עם PI-SceI ו-I-CeuI, בהתאמה. (C) עיכול אנליטי עם HincII של שיבוטי pAdVFTC עם ובלי GOI. (D) שחרור של גנום ה-HCAdV הנושא את ה-GOI מתוך pAdVFTC-GOI על ידי עיכול עם NotI

איור 2. תוצאות מייצגות לאחר סבב צנטריפוגציה במדרג של צסיום כלוריד (CsCl). (A) לאחר ביצוע מדרג מדורג (ראו גם שלב 1.5); (B) לאחר מדרג רציף (ראו גם שלב 1.7).

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה

שם	חברה	מספר קטלוג	הערות
מבחנות Ultra Clear לאולטרסנטריפוגה	Beckmann Coulter	344059	סנטריפוגת מדרג צפיפות
אולטרסנטריפוגה	Beckmann Coulter		סנטריפוגת מדרג צפיפות
רוטור SW-41	Beckmann Coulter		סנטריפוגת מדרג צפיפות
ממברנת Spectrapor של Spectrum Laboratories	VWR	132129	שקי דיאליזה
קסטות דיאליזה מוכנות לשימוש	Thermo	66383	דיאליזה
Cesium chloride	Carl Roth	8627.1	סנטריפוגת מדרג צפיפות
מצע LB	Carl Roth	X968.3	מצע גידול בקטריאלי
Tris-HCl 99%	Carl Roth	9090.3	בפר דיאליזה/בפר ליזיס
Glycerol 99.5%	Carl Roth	3783.1	בפר דיאליזה
MgCl₂ 98.5%	Carl Roth	KK36.2	בפר דיאליזה
NaCl	Carl Roth	3957.1	בפר דיאליזה אופציונלי
KH₂PO₄	Carl Roth	3904.2	בפר דיאליזה אופציונלי
Sucrose	Carl Roth	9286.1	בפר דיאליזה אופציונלי
Na₂HPO₄·2H₂O	Carl Roth	4984.2	בפר דיאליזה אופציונלי
מבחנות 1.5 ml	sarstedt	72,730,005	אחסון של תכשירים ויראליים ב-80 °C-