החדרה ויראלית של גנים ללב העכבר להערכת השפעות גנים על תפקוד הלב

תקציר

ביטוי של טרנסגן ויראלי ברקמות חודר של מכרסמים הערה: יש לאחסן אדנו-וירוס רקומביננטי או וירוס אדנו-אסוסיאטיבי (AAV) המבטא את הגן מטרה ואת וירוס הבקרה המתאים, כגון Ad-GFP (חלבון פלואורסצנטי ירוק) (טיטר של 1 x 10^10 יחידות יוצרי פלאק [PFU]/מ"ל) או AAV9-GFP (טיטר של 1 x 10^13 עותקי גנום [GC]/מ"ל) (ראה טבלת חומרים), במקפיא של 80°C-. ביום ההזרקה של הווירוס, יש להפשיר את הווירוס על קרח. שאבו את הווירוס המבטא את הגן מטרה ואת וירוס הבקרה לשתי מזרקים נפרדים (נפח = 50 מיקרוליטר) עם מחטים של 30 G ½ ושמרו על קרח עד לשימוש. הערה: יש להסיר בזהירות כל בועה מהמזרק ומהמחט. ניתנו בופרנורפין לחולדות או לעכברים (0.05 מ"ג/ק"ג לחולדות, 0.1 מ"ג/ק"ג לעכברים, תת-עורי); שעה לאחר מכן, השרו הרדמה באמצעות איזופלורן 3%, ושמרו על ריכוז איזופלורן של 2% (ב-100% חמצן בקצב זרימה של 0.5-1.0 ליטר/דקה) לצורך הפרוצדורה הבאה. צבטו בעדינות את גוף החיה (למשל, את הזנב) באמצעות פינצטה, ואם החיה אינה מגיבה לצביטה בתנועות גוף כלשהן, ההרדמה התקינה מאושרת. שמרו על טמפרטורת גוף של 37°C באמצעות פד חימום חשמלי. גלחו את הפרווה באזור החזה באמצעות מכונת גילוח. הערה: יש לנקוט זהירות בעת שימוש בפד חימום חשמלי בשל פוטנציאל לפיזור חום לא אחיד. מרחו משחה עינית בשתי העיניים כדי למנוע התייבשות של הקרנית. הניחו את החיה במצב שכיבה על הגב והשתמשו במערכת דימות פרה-קלינית (ראה טבלת חומרים) לצורך דימוי אולטרסאונד של לב החיה בכיוון הציר הקצר. הערה: השלבים הבאים מבוצעים בתוך קבמינת בטיחות ביולוגית דרגה II המספקת סביבה סטרילית. ננקטים נהלי בטיחות סטנדרטיים, כולל נהלים לטיפול בטוח במחטים. סטריליזו את אזור החזה השמאלי התחתון של החיה באמצעות סבבים לסירוגין של קרצוף מבוסס יוד או כלורהקסידין ואלכוהול, שלוש פעמים בתנועה סיבובית. תחת הדרכת דימוי אולטרסאונד, החדירו את מחט ה-30 G 1/2 של המזרק המכיל את הווירוס כפי שהוכן בשלב 1.1 לתוך חזה החיה דרך צד החזה השמאלי התחתון של הגוף. קרבו את קצה המחט לדופן החופשית הקדמית של החדר השמאלי והזריקו באיטיות 10-15 מיקרוליטר מהווירוס. ודאו את הצלחת ההזרקה בתמונות האולטרסאונד על ידי בהירות מוגברת סביב קצה המחט. הערה: כמות הווירוס המוזרקת בכל אתר אינה עולה על 15 מיקרוליטר כדי למנוע נזק פיזי לרקמות השריר הלבבי. הוציאו את המחט מהלב והחדירו אותה לאזורים אחרים של החדר השמאלי להזרקה שנייה ושלישית של אותה כמות וירוס. הערה: מספר אתרי ההזרקה הכולל נקבע לפי התכנון הניסויי. אם נדרש ביטוי טרנסגן מוקדי, נדרשת הזריקה אחת בלבד; אם נדרש ביטוי טרנסגן דיפוזי יותר, בדרך כלל נדרשים מספר אתרי הזרקה (שלושה עד חמישה). בסיום ההזרקות, החזירו את החיה לכלוב שלה. עקבו בזהירות אחר החיה עד שתחזור למצב הכרה מספיק כדי לשמור על שכיבה על הבטן, והחזירו אותה לחדר הגידול. ניתנו בופרנורפין הידרוכלוריד (0.1 מ"ג/ק"ג, פעמיים ביום לעכברים, 0.05 מ"ג/ק"ג, פעמיים ביום לחולדות, תת-עורי) לחיה במהלך יומיים הבאים. החזירו את החיות לבית הגידול (vivarium) ועקבו מדי יום אחר סימנים חריגים של כאב או מצוקה, ובמידה ונמצאו, טפלו בחיות בהתאם לפרוטוקולים של ועדת הרווחה לבעלי חיים המוסדית. לו, א., וכ') ביטוי טרנסגן ויראלי בלבבות של מכרסמים והערכת הסיכון להפרעות קצב לבביות. J. Vis. Exp. (2022)

הסרטון מדגים שיטה להזרקה תוך-שרירית של וקטור נגיפי רקומביננטי לשריר הלב בהנחיית אולטרסאונד במודל עכבר. טכניקה זו מאפשרת העברה ממוקדת של גנים ללב לצורך חקר ההשפעות של ביטוי טרנסג'ן על התפקוד הלבבי.

פרוטוקול

1. ביטוי טרנסגן ויראלי ברקמות חדרים של מכרסמים

הערה: אחסן אדנווירוס רקומביננטי או וירוס מקושר-אדנו (AAV) (AAV) המבטא את הגן המטרה ואת נגיף הבקרה התואם, כגון Ad-GFP (חלבון פלואורסצנטי ירוק) (טר בערך של 1 x 10¹⁰ יחידות יוצרות פלאק [PFU]/מ"ל) או AAV9-GFP (טר של 1 x 10¹³ עותקים גנומיים [GC]/מ"ל) (ראה טבלת חומרים), במקפיא בטמפרטורה של −80 °C מקפיא.

1. ביום הזרקת הנגיף, הפשיר את הנגיף על קרח. שאב את הנגיף המבטא את הגן המטרה ואת נגיף הביקורת לשתי מזרקים נפרדים (נפח = 50 µL) עם מחטים מדגם 30 G ½ ושמור על קרח עד לשימוש.
   הערה: יש להוציא בזהירות את כל הבועות מהמזרק ומהמחט.
2. ניתן בופרנולפין (buprenorphine) לחולדות או לעכברים (0.05 mg/kg לחולדות, 0.1 mg/kg לעכברים, בהזרקה תת-עורית); שעה לאחר מכן, השר את בעל החיים באנסטזיה באמצעות 3% isoflurane, ושמור על ריכוז isoflurane של 2% (ב-100% חמצן בקצב זרימה של 0.5-1.0 L/min) למשך ההליך הבא.
3. צבוט בעדינות את גוף בעל החיים (למשל, את הזנב) באמצעות פינצטה; אם בעל החיים אינו מגיב לצביטה בתנועות גוף כלשהן, ניתן לאשש כי ההרדמה תקינה.
4. שמור על טמפרטורת הגוף ב-37 °C באמצעות פד חימום חשמלי. גלח את הפרווה באזור החזה באמצעות מכונת גילוח.
   הערה: יש לנקוט זהירות בעת שימוש בפד חימום חשמלי בשל פוטנציאל לפיזור חום לא אחיד.
5. מרח משחה עינית בשתי העיניים כדי למנוע התייבשות של הקרנית.
6. השאר את בעל החיים בתנוחה גבית (supine) והשתמש במערכת דימות פרה-קלינית (ראה טבלת חומרים) לצורך דימות אולטרסאונד של לב בעל החיים באוריינטציית ציר קצר (short-axis orientation).
   הערה: השלבים הבאים מבוצעים במCבט בטיחות ביולוגית רמה II המספק סביבה סטרילית. מיושמים נהלי בטיחות סטנדרטיים, כולל נהלים לטיפול בטוח במחטים.
7. סטריליז את האזור השמאלי התחתון של חזה בעל החיים באמצעות סבבים לסירוגין של תמיסת קרצוף מבוססת יוד או כלורהקסידין ואלכוהול, שלוש פעמים בתנועה סיבובית.
8. תחת הנחיית דימות אולטרסאונד, החדר את מחט ה-30 G 1/2 של המזרק המכיל את הנגיף כפי שהוכן בשלב 1.1 לחזה בעל החיים דרך הצד השמאלי התחתון של החזה.
9. קרב את קצה המחט אל הדופן החופשית הקדמית של החדר השמאלי והזרק לאט 10-15 μL מהנגיף. ודא את הצלחת ההזרקה בתמונות האולטרסאונד על ידי בהירות מוגברת סביב קצה המחט.
   הערה: כמות הנגיף המוזרקת בכל נקודה אינה עולה על 15 μL כדי למנוע נזק פיזי לרקמות השריר הלבבי.
10. שלוף את המחט מהלב והחדר אותה לאזורים אחרים של החדר השמאלי להזרקה שנייה ושלישית של אותה כמות נגיף.
    הערה: מספר נקודות ההזרקה הכולל נקבע על פי התכנון הניסויי. אם נדרש ביטוי ממוקד של הגן התחליפי (transgene), נדרשת הזרקה אחת בלבד; אם נדרש ביטוי נפיץ יותר של הגן התחליפי, נדרשות בדרך כלל מספר נקודות הזרקה (שלוש עד חמש).
11. עם סיום ההזרקות, החזר את בעל החיים לכלובו.
12. עקוב בזהירות אחר בעל החיים עד שיחזור להרהורי הכרה מספיקים כדי לשמור על תנוחת שכיבה על הבטן (sternal recumbency), והחזר אותו לחדר הגידול.
13. תן לבעל החיים buprenorphine hydrochloride (0.1 mg/kg, פעמיים ביום לעכברים, 0.05 mg/kg, פעמיים ביום לחולדות, בהזרקה תת-עורית) במהלך יומיים הבאים. החזר את בעלי החיים לבית הגידול (vivarium) ועקוב מדי יום אחר סימנים חריגים של כאב או מצוקה, ובמידה ויימצאו, טפל בבעלי החיים בהתאם לפרוטוקולים של ועדת הרווחה לבעלי חיים המוסדית.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה

שם	חברה	מספר קטלוג	הערות
מחט PrecisionGlide 30 G ½	Becton Dickinson (BD)	305106
וירוס אדנו-אסוצייטיבי (AAV9 המבטא חלבון פלואורסצנטי ירוק (GFP))	Vector Biolabs	7007
אדנו-וירוס (Ad-GFP)	Vector Biolabs	1060
מCב בטיחות ביולוגית (דרגה II)	Microzone Corporation	N/A	דגם #: BK-2-4
בופרנורפין (Buprenorphine)	Vetergesic	DIN 02342510
מכונת גילוח	WAHL Clipper Corporation	78001
מזרקת המילטון (Hamilton syringe)	Sigma-Aldrich	20701	705 LT, נפח 50 μL
מדחם חשמלי/פד חימום	Life Brand	E12107
איסופלורן (Isoflurane)	Fresenius Kabi Ltd.	M60303
עכברים (Ctnnb1flox/flox)	Jackson Labs	4152
עכברים (αMHC-MerCreMer)	Jackson Labs	5650
משחה עינית	Systane	DIN 02444062
חולדה (Sprague-Dawley, זכר)	Charles River	400
להבי סקאלפל	Fine Science Tools	10010-00
ידית סקאלפל	Fine Science Tools	10007-12
מערכת VEVO3100 לדימות פרה-קליני	VisualSonic Inc.	N/A