מאמר שיטה

טרנסדוקציה של כבד חולדה אנושיה באמצעות וקטורים של וירוס אדנו-אסוסיאטיבי (AAV)

42 צפיות

31 באוגוסט 2026

במאמר זה

תקציר

העברה גנטית (טרנסדוקציה) של מודל כבד כוונן את תמיסת וקטור הנגיף האסוסיאטיבי (AAV) לריכוז סופי של 2.7 x 10¹³ גנומי וקטור ב-5 מ"ל על ידי הוספת הנפח המתאים של תמיסת סליין עם בופר פוספט (PBS). נתק את הכבד ממעגל המדיום על ידי הסרת הצינורית מהקנולה. חבר מזרק של 5 מ"ל לקנולה של הווריד השער (portal vein) והזרק את כל תמיסת וקטור ה-AAV (5 מ"ל). הערה: באופן רשות, ניתן להוסיף פנול אדום (5 µg/ml) כדי לעקוב אחר התפזורות של תמיסת וקטור ה-AAV ברחבי הכבד. דגור למשך שעה אחת ללא דחיפה. הגבר בהדרגה את קצב הזרימה, החל מ-1.25 מ"ל/דקה למשך 10 דקות; 2.5 מ"ל/דקה למשך 20 דקות ו-3.75 מ"ל/דקה למשך 30 דקות. תרבל את כבד החולדה שעבר רסולולריזציה (recellularized) במשך 6 ימים. הערה: החלף שליש מהמדיום במדיום טרי (50 מ"ל) מדי יומיים. דגום את מדיום התרבית כדי למדוד פרמטרים פיזיולוגיים, כגון פעילות לקטט דהידרוגנאז, ה-pH של דגימות המדיום וריכוזי הגלוקוז והלקטט. הילר, T., ואחריםמחקר של וקטורים ויראליים במודל כבד תלת-ממדי שאוכלס מחדש באמצעות קו תאי קרצינומה הפטוצלולרית אנושית HepG2. J. Vis. Exp., (2016)

סרטון זה מדגים העברה של גנים באמצעות נגיף אדנו-אסוסיאטיבי (adeno-associated virus) בתוך פיגום של כבד חולדה אנושי. הווקטור מעביר טרנסגן המקודד לחלבון דחליל פלואורסצנטי ול-RNA המשתיק גנים אל תאי הכבד באמצעות אנדוציטוזיס מתווכת רצפטורים. מודל זה תומך בטרנסדוקציה יעילה במערכת רקמת כבד תלת-ממדית עם פרפוזיה.

פרוטוקול

טרנסדוקציה של מודל כבד

  1. כוונן את תמיסת וקטור הנגיף המקושר-אדנו (AAV) לריכוז סופי של 2.7 x 1013 גנומי וקטור ב-5 ml על ידי הוספת הנפח המתאים של תמיסת סליין עם בופר פוספט (PBS).
  2. נתק את הכבד ממעגל המדיום על ידי הסרת הצינורית מהקנולה. חבר מזרק של 5 ml לקנולה של הווריד הפורטלי והזרק את כל תמיסת וקטור ה-AAV (5 ml).
  3. הערה: ניתן להוסיף, כפי желание, phenol red (5 µg/ml) כדי לעקוב אחר התפזורות של תמיסת וקטור ה-AAV ברחבי הכבד.
  4. דגור למשך 1 hr ללא פנימה. הגבר בהדרגה את קצב הזרימה, החל מ-1.25 ml/min למשך 10 min; 2.5 ml/min למשך 20 min ו-3.75 ml/min למשך 30 min. תרבל את כבד החולדה שעבר recellularization במשך 6 ימים.
  5. הערה: החלף שליש מהמדיום במדיום טרי (50 ml) מדי יומיים. דגום את מדיום התרבית כדי למדוד פרמטרים פיזיולוגיים, כגון פעילות lactate dehydrogenase, ה-pH של דגימות המדיום וריכוזי הגלוקוז והלקטט.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
אינקובטורFraunhofer/ 
משאבה פריסטלטיתFraunhofer/ 
אוגן עם חריץDuran2439454 
טבעת אטם (O-Ring) שקופהDuran2922551 
סוגר לשחרור מהירDuran2907151 
מכסה אוגן שטוחDuran2429857 
מבחנה עם הברגהDuran2483802 
מבחנה עם הברגהDuran2483602 
טבעת איטום סיליקוןDuran2862012 
מכסה הברגהDuran2924013 
מכסה הברגהDuran2924008 
מכסה הברגה עם פתחDuran2922709 
מכסה הברגה עם פתחDuran2922705 
מסנןSarstedt831,826,001 
צינור סיליקוןVWR228-1500 
מחבר צינורותIsmatecISM556A 
צינור תואם ביולוגיתIsmatecSC0736 
בקבוקי תרבית T175Greiner bio-one660 160 
RPMI 1640BioWest SAS (Th. Geyer)L0501-500 
גלוטמיןBioWest SAS (Th. Geyer)X0551-100 
טריפסיןBioWest SAS (Th. Geyer)L0940-100 
פניצילין/סטרפטומייציןBioWest SAS (Th. Geyer)L0022-100 
סרום עגל עו בריcc proS-10-M 
HepG2DSMZACC 180 

תגיות

RNA