אישור טרנסדוקציה ויראלית בכבד חולדה שעבר רסלולריזציה באמצעות צביעה אימונוהיסטוכימית

תקציר

1. טרנסדוקציה של כבד חולדה שעבר רצלוולריזציה ייצור רחב-היקף של וקטור ויראלי המופק מנגיפי adeno-associated (וקטור AAV) ייצור, טיהור וכימות של וקטורי AAV: בקיצור, ייצרו וקטורי AAV בבקבוקי גלגול (roller bottles) וטהרו אותם באמצעות סבב צנטריפוגה במדרגת iodixanol. הסירו שאריות iodixanol באמצעות סינון בעמודי סינון ג'ל מסוג PD10. קבעו את ריכוז וקטור ה-AAV באמצעות תגובת שרשרת פולימראז כמותית (qPCR) תוך שימוש ב-DNA גנומי של AAV כסטנדרט. הערה: וקטור AAV2/6 פסאודו-טיפי ועצמי-משלים ששימש במחקר הנוכחי קידד חלבון דיווח פלואורסצנטי ירוק מסוג emerald, EmGFP, כדיווח להדגמת יעילות הטרנסדוקציה, וקסטת ביטוי של RNA בעלת סיכה קצרה (shRNA) להשתקת גן המבטא באופן אנדוגני (cyclophilin B אנושי (hCycB), איור 1). ודאו כי קיימת כמות מספקת של וקטורי scAAV פסאודו-טיפיים מסרוטיפ 6 (2.7 x 10^13 וקטורי AAV לכל מודל כבד). טרנסדוקציה של מודל כבד התאימו את תמיסת וקטור ה-AAV לריכוז סופי של 2.7 x 10^13 גנומי וקטור ב-5 מ"ל על ידי הוספת הנפח המתאים של תמיסת סליין בבופר פוספט (PBS). נתקו את הכבד ממעגל המדיום על ידי הסרת הצינוריות מהקנולה. חברו מזרק של 5 מ"ל לקנולה של הווריד הפורטלי והזריקו את תמיסת וקטור ה-AAV המלאה (5 מ"ל). הערה: באופן רשות, ניתן להוסיף phenol red (במינון 5 µg/ml) כדי לעקוב אחר התפזורות של תמיסת וקטור ה-AAV ברחבי הכבד. דגרו למשך שעה אחת ללא שאיבה. הגבירו את קצב הזרימה בהדרגה, החל מ-1.25 מ"ל/דקה למשך 10 דקות; 2.5 מ"ל/דקה למשך 20 דקות ו-3.75 מ"ל/דקה למשך 30 דקות. תרבתו את כבד החולדה שעבר רצלוולריזציה במשך 6 ימים. 2. הערכה של כבד חולדה שעבר רצלוולריזציה וטרנסדוקציה צביעת hematoxylin and eosin (HE) וניתוח אימונוהיסטוכימי קחו דגימות (0.5 x 0.5 x 1.5-2 ס"מ) מכל אונה של הכבד באמצעות סקלפל. דגרו את הדגימות בתמיסה של 4% paraformaldehyde (PFA) + 4% סוכרוז למשך 1.5 שעות ב-4 °C. (זהירות: PFA הוא רעיל ומסרטן. יש להחזיק את ה-PFA תמיד בתוך מנדף וללבוש ביגוד מגן מתאים.) שטפו שלוש פעמים עם PBS (דקה אחת לכל שלב שטיפה) ודגרו ב-8% סוכרוז למשך לילה ב-4 °C. שפכו את מדיום הקיבוע לתבניות קריו-פלסטיות, והניחו את הדגימות בתוך מדיום הקיבוע, ללא בועות אוויר. הוסיפו מדיום קיבוע עד שהדגימה מכוסה היטב. אחסנו דגימות טמיעות ב-80 °C- עד לשימוש נוסף. הכינו חתכים קריוגניים (10 µm) באמצעות קריוטום. העריכו את הרצלוולריזציה באמצעות צביעת hematoxylin + eosin. העריכו את יעילות הטרנסדוקציה באמצעות צביעה אימונוהיסטוכימית לגן המדובר (במקרה זה: EmGFP). הילר, T. ועמיתיהם מחקר של וקטורים ויראליים במודל כבד תלת-ממדי שאוכלס מחדש עם שורת תאי קרצינומה הפטוצלולרית אנושית HepG2. .J. Vis. Exp (2016)

סרטון זה מדגים צביעה אימונוהיסטוכימית להערכת העברה של גנים ויראליים במודל של כבד חולדה שעבר דה-צלולריזציה ורי-צלולריזציה (recellularized). ביטוי של חלבון דגל, שאושש באמצעות זיהוי נוגדנים וקו-לוקליזציה עם צביעה גרעינית, מעיד על טרנסדוקציה ויראלית מוצלחת בתאים.

פרוטוקול

1. טרנסדוקציה של כבד חולדה שעבר רסלולריזציה

1. ייצור בקנה מידה גדול של וקטור ויראלי המופק מנגיפיםに関連ים לאדנו (AAV vector)
   1. ייצור, טיהור וכימות של וקטורי AAV:
      1. בקצרה, ייצרו וקטורי AAV בבקבוקי גלילה (roller bottles) וטהרו אותם באמצעות סנטריפוגציה במדרג iodixanol. הסירו שאריות iodixanol על ידי סינון דרך עמודי סינון ג'ל PD10. קבעו את ריכוז וקטור ה-AAV באמצעות תגובת שרשרת פולימראז כמותית (qPCR) תוך שימוש ב-DNA גנומי של AAV כסטנדרט.
         הערה: וקטור ה-AAV2/6 הפסאודו-טיפי והעצמי-משלים (self-complementary) ששימש במחקר הנוכחי קידד חלבון דווח פלואורסצנטי ירוק מסוג emerald, EmGFP, כדווח להדגמת יעילות הטרנסדוקציה, וקסט של ביטוי RNA בעלת מבנה סיכת ראש קצרה (shRNA) לצורך השתקה (knockdown) של גן המבוטא אנדוגנית (cyclophilin B אנושי (hCycB), איור 1). ודאו כמות מספקת של וקטורי scAAV פסאודו-טיפיים מסרוטיפ 6 (2.7 x 10¹³ וקטורי AAV לכל מודל כבד).
2. טרנסדוקציה של מודל כבד
   1. כווננו את תמיסת וקטור ה-AAV לריכוז סופי של 2.7 x 10¹³ גנומים של וקטור ב-5 mL על ידי הוספת הנפח המתאים של תמיסת סליין מחויצת פוספט (PBS).
   2. נתקו את הכבד ממעגל המדיום על ידי הסרת הצינורית מהקנולה. חברו מזרק של 5 mL לקנולה של הווריד השער (portal vein) והזריקו את מלוא תמיסת וקטור ה-AAV (5 mL).
      הערה: במידת הצורך, ניתן להוסיף phenol red (5 µg/ml) כדי לעקוב אחר התפזורות של תמיסת וקטור ה-AAV ברחבי הכבד.
   3. דגרו למשך שעה אחת ללא שאיבה. הגבירו בהדרגה את קצב הזרימה, החל מ-1.25 ml/min למשך 10 דקות; 2.5 ml/min למשך 20 דקות ו-3.75 ml/min למשך 30 דקות. תרבתו את כבד החולדה שעבר רסלולריזציה במשך 6 ימים.

2. הערכה של כבד חולדה שעבר רסלולריזציה והחדרת וקטור (Transduction)

1. צביעת המטוקסילין ואאוזין (HE) ואנליזה אימונוהיסטוכימית
   1. קחו דגימות (0.5 x 0.5 x 1.5-2 cm) מכל אונה של הכבד באמצעות סכין מנתחים.
   2. דגרו את הדגימות בתמיסת 4% paraformaldehyde (PFA) + 4% sucrose למשך 1.5 hr ב-4 °C. (זהירות: PFA הוא רעיל ומסרטן. יש להחזיק את ה-PFA תמיד בתוך מנדף לביש וללבוש ביגוד מגן מתאים.) שטפו שלוש פעמים ב-PBS (דקה אחת לכל שלב שטיפה) ודגרו ב-8% sucrose למשך הלילה ב-4 °C.
   3. שפכו את תוכה המקבע לתבניות קריו-פלסטיק, והניחו את הדגימות בתוך תוכה המקבע, ללא בועות אוויר. הוסיפו תוכה מקבע עד שהדגימה מכוסה היטב. אחסנו את הדגימות המוטמנות ב- -80 °C עד לשימוש נוסף.
   4. הכינו חתכי קריו (10 µm) באמצעות קריוטום. העריכו את הרצלוסליזציה באמצעות צביעת המטוקסילין + אאוזין. העריכו את יעילות הטרנסדוקציה באמצעות צביעה אימונוהיסטוכימית עבור הגן המבוקש (כאן: EmGFP).

תוצאות

איור 1. מפה של וקטור AAV2/6 פסאודו-טיפי, עצמי-משלים (self-complementary), שנעשה בו שימוש במחקר הנוכחי. הגנום מורכב מהחזרות טרמינליות הפוכות (ITR) של AAV2 ומקודד עבור EmGFP תחת בקרת מקדם CMV, וכן עבור shRNA תחת בקרת מקדם U6.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה

שם	חברה	מספר קטלוג	הערות
Tissue-Tek O.C.T.	Weckert-Labortechnik	600001
תבנית הקפאה (Cryomold) 15 x 15 x 5 mm	Sakura	4566
אינקובטור	Fraunhofer	/