יצירת קווי תאים שעברו טרנסדוקציה יציבה זריעה של תאי סרטן המעי הגס HCT16 ותאי סרטן השד MDA-MB-231 בריכוז של 50,0 תאים לבאר בתוך פלטה בעלת 12 בארות, במצע Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM) המועשר ב-10% סרום בקר עוברי (FBS) וב-1% פניצילין/סטרפטומייצין (Pen/Strep). דגירה בטמפרטורה של 37 °C וב-5% CO2 עד להגעה למfluence (צפיפות) של 60% - 70%. שטיפת התאים במי solução סליין פוספטי (PBS) והוספת 1 מ"ל של מצע המכיל וירוס לתאי הסרטן, ודגירה למשך לילה ב-37 °C וב-5% CO2. כביקורת, יש להוסיף 1 מ"ל של מצע DMEM טרי המועשר ב-10% FBS וב-1% Pen/Strep לשתי בארות עם תאי סרטן. הסרה זהירה של המצע המכיל וירוס באמצעות שאיבה. שטיפת התאים ב-PBS והחלפת המצע ל-DMEM עם 10% (נפח/נפח) FBS נטול טטרציקלין (Tet-free) ו-1% Pen/Strep. לאחר 72 שעות, שטיפת התאים ב-PBS והחלפת המצע ל-DMEM עם 10% Tet-free FBS, 1% Pen/Strep ו-1 µg/mL פומיצין (puromycin) לצורך סלקציה של התאים שעברו טרנסדוקציה וירוסית. בהתאם לקו התאים שבו נעשה שימוש, יש להתאים את ריכוז הפומיצין לסלקציה אופטימלית על ידי בדיקת טווח ריכוזי פומיצין (0.1, 0.5, 1, 2 ו-5 µg/mL) בתאים שלא עברו טרנסדוקציה, ובחירת הריכוז הנמוך ביותר שבו לא שורדים תאי ביקורת לאחר 3 ימי תרבית. ביצוע סלקציה לתאים שעברו טרנסדוקציה וירוסית על ידי גידול התאים בנוכחות פומיצין למשך 3 עד 14 ימים. כביקורות, יש להכין שתי בארות נוספות עם תאים שלא עברו טרנסדוקציה, אחת עם מצע המכיל פומיצין ואחת ללא פומיצין. יש להבחין בהריגה חלקית של התאים על ידי הפומיצין בבאר עם התאים שעברו טרנסדוקציה וירוסית בהשוואה לבארי הביקורת. הערה: תאים שלא עברו טרנסדוקציה לא יגדלו בנוכחות פומיצין. אימות יעילות ההשקתה (KD) המותנית בתאי סרטן המעי הגס HCT116 ותאי סרטן השד MDA-MB-231 העמידים לפומיצין. הערה: הריכוז האפקטיבי של דוקסיציקלין ישתנה בהתאם לקו התאים שבו נעשה שימוש ויש לבצע עבורו תיתוח (titration), בדרך כלל מ-10 ng/mL ועד 2 µg/mL. קביעת ריכוז הדוקסיציקלין שאינו רעיל לתאים אך יעיל בהורדת הביטוי של החלבון המבוקש. בפרוטוקול זה, נעשה שימוש מוצלח בריכוז של 1 µg/mL in vitro. גידול התאים למשך 72 שעות בנוכחות ובסמיות של 0.1, 1 ו-2 µg/mL דוקסיציקלין. אימות רמת הביטוי של החלבון שהורד (במקרה זה, plasminogen activator inhibitor 1 (PAI-1)) בליזאט התאים באמצעות אנליזת Western blot. השוואת תאי HCT16 ו-MDA-MB-231 המבטאים באופן מותנה RNA בעל סיכה קצרה (shRNA) לתאי ביקורת מסוג scrambled. קובאלה, מ. ה. & DeClerck, Y. A. השתקה מותנית של ביטוי גנים בקווי תאי סרטן לחקר גיוס מונוציטים/מקרופאגים לסביבת התאים של הגידול. .J. Vis. Exp (2017)
סרטון זה מדגים את יצירתן של שורות תאי סרטן עם השתקה מותנית (conditional knockdown) באמצעות מערכת shRNA לנטיביריאלית הניתנת להשראה על ידי Tet. הוא מפרט את השלבים של טרנסדוקציה ויראלית, סלקציה אנטיביוטית והשתקת גנים המשרה על ידי doxycycline.
