הכנת תרחיף מועשר בנגיף באמצעות סרימרטריפוגציה של סוכרוז במדרגות

תקציר

מקור: Vijayraghavan, S. ו-Kantor, B. פרוטוקול להפקה של וקטורים לנטיביריאליים חסרי אינטגראז עבור השתקת גנים באמצעות CRISPR/Cas9 בתאים מתחלקים. .J. Vis. Exp, (2017)

סרטון זה מדגים שיטת אולטרסנטריפוגציה בשני שלבים המשתמשת במדרגי סוכרוז ובכריות סוכרוז כדי לטהר ולרכז חלקיקים ויראליים מתוצר לוואי של תרבית תאים. הפרוצדורה מאפשרת הפרדה המבוססת על צפיפות ציפה, ובכך מאפשרת השבה של וירוס שלם המתאים ליישומים המשכיים.

פרוטוקול

1. ריכוז חלקיקי נגיף באמצעות אולטרסנטריפוגציה

הערה: אנו משתמשים בשיטת טיהור של סוכרוז כפול הכוללת שני שלבים: שלב של מדרג סוכרוז ושלב של כרית סוכרוז (איור 1).

1. מלאו את מבחנות האולטרסנטריפוגה הקוניות בסדר הבא כדי ליצור גרדיאנט סוכרוז: 0.5 mL סוכרוז 70% (מומס ב-1x phosphate-buffered saline [PBS]), 0.5 mL סוכרוז 60% (מומס ב-DMEM), 1 mL סוכרוז 30% (מומס ב-Dulbecco's Modified Eagle Medium [DMEM]), ו-2 mL סוכרוז 20% (מומס ב-1x PBS).
2. הוסיפו בזהירות את העלייה (supernatant) המכילה את הווירוס אל הגרדיאנט. מכיוון שהנפח הכולל של העלייה מארבע צלחות של 15 cm הוא 100 mL, השתמשו בשישה מבחנות אולטרסנטריפוגה לכל סבב כדי לעבד את מלוא נפח העלייה של הווירוס.
   1. לכל מבחנת אולטרסנטריפוגה המשמשת לשלב זה יש קיבולת נפח של עד 30 mL (כולל נפח הסוכרוז). חלקו את העלייה הוויראלית באופן שווה בין המבחנות, והשאירו מרווח של לפחות 10% בחלק העליון כדי למנוע נשפך.
   2. בשימוש ביותר מארבע צלחות של 15 cm לכל ניסוי, התאימו את נפח התרבית ל-~20 - 22 mL לצלחת, כך שהנפח הסופי של העלייה הוויראלית המאוחדת יוכל להיכנס בקלות לתוך שש מבחנות אולטרסנטריפוגה.
   3. מלאו את מבחנות האולטרסנטריפוגה לפחות עד לשלושה רבעים מקיבולת הנפח הכוללת שלהן, אחרת עלולה להתרחש שבירה של המבחנות במהלך הסנטריפוגציה, מה שעלול להוביל לאובדן של הדגימה ו/או נזק לציוד.
3. אזנו את המבחנות עם 1x PBS וסנטריפוגו את הדגימות ב-70,000 x g למשך 2 h ב-17 °C
   הערה: כדי למנוע שיבוש של שכבת הסוכרוז במהלך ההאצה, הגדירו באולטרסנטריפוגה האצה איטית של הרוטור ל-200 rpm במהלך 3 הדקות הראשונות של הסבב. באופן דומה, הגדירו באולטרסנטריפוגה האטה איטית של הרוטור מ-200 rpm ל-0 rpm במשך 3 דקות בסיום הסבב.
4. אספו בזהירות את פראקציות הסוכרוז של 30 - 60% למבחנות נקיות (איור 1). הוסיפו 1x PBS קר לפראקציות המאוחדות והביאו את הנפח ל-100 mL; ערבבו על ידי פיפוט למעלה ולמטה מספר פעמים.
5. עברו לשלב כרית הסוכרוז (sucrose cushion) על ידי הנחה זהירה של התכשיר הוויראלי על כרית סוכרוז. לשם כך, הוסיפו 4 mL של סוכרוז 20% (ב-1x PBS) למבחנה, ולאחר מכן ~20 - 25 mL של התמיסה הוויראלית למבחנה. אם המבחנות מלאות בפחות משלושה רבעים, השלימו את הנפח עם 1x PBS סטרילי.
6. אזנו בזהירות וסנטריפוגו את הדגימות ב-70,000 x g למשך 2 h ב-17 °C, כפי שבוצע קודם לכן. שפכו את העלייה ואפשרו לנוזל הנותר להתנקז על ידי הפיכת המבחנות על נייר סופג.
7. שאבו את הטיפות שנותרו כדי להסיר את כל הנוזל מהמשקע (pellet). בשלב זה, המשקעים המכילים את הווירוס צריכים להיות בקושי נראים ככתמים שקופים קטנים.
8. החזירו את המשקעים לתמיסה על ידי הוספת 70 µL של 1x PBS למבחנה הראשונה ופיפוט יסודי של התמיסה, לאחר מכן העבירו את התמיסה למבחנה הבאה וערבבו כפי שבוצע קודם לכן, והמשיכו עד שכל המשקעים יוחזרו לתמיסה.
9. שטפו את המבחנות עם 50 µL נוספים של 1x PBS קר וערבבו כפי שבוצע קודם לכן. ודאו שהנפח המשולב של התמיסה הסופית הוא ~120 µL, ושהיא נראית חלבית מעט; הבהירו אותה על ידי סנטריפוגציה ב-10,000 x g למשך 30 s במיקרוסנטריפוגה שולחנית.
10. העבירו את העלייה למבחנת מיקרופוג נקייה, הכינו אליקוטות של 10 µL, ואחסנו אותן ב-80 °C-.
    הערה: הימנעו מביצוע מחזורי הקפאה-הפשרה חוזרים על דגימות הלנטי-וירוס. למעט כאשר נדרשת סנטריפוגציה, יש לעשות מאמצים לבצע את השלבים הנותרים במכסיסות לתרביות רקמה או בחדרים המיועדים לתרביות רקמה תוך שימוש באמצעי בטיחות ביולוגית מתאימים

תוצאות

איור 1: ריכוז של חלקיקי נגיף באמצעות פרוטוקול של גרדיאנט סוכרוז כפול. חלקיקי נגיף שנאספו מהעליון (SN) נטענים על גרדיאנט סוכרוז. תמיסות סוכרוז בריכוזים של 70%, 60%, 30% ו-20% משמשות ליצירת הגרדיאנט. לאחר סבוב בצנטריפוגה, החלקיקים שנאספו מפראקציות הסוכרוז של 30-60% נטענים בהמשך על כרית סוכרוז של 20% ושוקעים. המשקע הסופי המכיל חלקיקי נגיף מטוהרים מומס מחדש ב-1x PBS לשימוש עתידי.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה

שם	חברה	מספר קטלוג	הערות
ציוד
Optima XPN-80 Ultracentrifuge	Beckman Coulter	A99839
Allegra 25R tabletop centrifuge	Beckman Coulter	369434
מבחנות אולטרסנטריפוגה בעלות תחתית קונית	Seton Scientific	5067
מתאמי מבחנות קוניות	Seton Scientific	PN 4230
SW32Ti swinging-bucket rotor	Beckman Coulter	369650
מבחנות צנטריפוגה קוניות 50mL	Corning	430291
פיפטות לתרביות רקמה, 25 mL	Corning	4489