הערכת טר לנטיוירוס באמצעות סבב של בדיקת ספיחה חיסונית מקושרת לאנזים (ELISA)

תקציר

מקור: ויג'יירגהבן, ס., ועוד. פרוטוקול להפקה של וקטורים לנטיביריים חסרי אינטגראז עבור השתקת גנים באמצעות CRISPR/Cas9 בתאים מתחלקים. J. Vis. Exp. (2017).

סרטון זה מדגים את השימוש ב-p24 ELISA להערכת טירים ויראליים של וקטורים לנטי-ויראליים. הבדיקה כוללת ליזיס של חלקיקים ויראליים לשחרור p24, לכידה שלו באמצעות נוגדנים ספציפיים, וזיהויו באמצעות מערכת המקושרת לפרוקסידאז המייצרת שינוי צבע מדיד. על ידי השוואת ערכי הבליעה של הדגימה לעקומה סטנדרטית, ניתן לכמת את הטיר הויראלי.

פרוטוקול

1. הערכת טריטרים ויראליים

1. שיטת ספיחה חיסונית קשורה לאנזים (ELISA) עבור p24 (חלבון הקפסיד p24 של נגיף הכשל החיסוני האנושי (HIV)-1) הערה: הבדיקה מבוצעת באמצעות פלטות בעלות 96 בארות בעלות קישוריות גבוהה (high-binding), בהתאם להוראות של תוכנית חיסון ה-AIDS של ה-NIH עבור ערכה לבדיקת לכידת אנטיגן p24 של HIV-1 (ראה טבלת חומרים) עם שינויים.
   1. ביום למחרת, שטפו את הבארות שלוש פעמים עם 200 µL 0.05% Tween 20 ב-PBS קר (תמיסת PBS-T). כסו את הפלטה ב- 100 µL של נוגדן מונוקלונלי przeciw-p24 בדילול של 1:1500 ב-1x PBS והדגירה למשך לילה ב- 4 °C.
   2. כדי למנוע קישור לא ספציפי, חסמו את הפלטה עם 200 µL 1% BSA ב-PBS; שטפו שלוש פעמים עם 200 µL 0.05% Tween 20 ב-PBS קר (תמיסת PBS-T) למשך שעה אחת לפחות בטמפרטורת החדר.
   3. הכנת דגימות: עבור תכניות וקטור ריכוזיות, דללו 1 µL של הדגימה בדילול של 100-פעמים באמצעות הוספת 89 µL של dd-H2O ו- 10 µL של Triton X-100 (ריכוז סופי של 10%). עבור תכשירים שאינם מרוכזים, הכין דגימות בדילול של פי 10 (הוסף 80 µL של dd-H20 ו- 10 µL של Triton X-100 (ריכוז סופי של 10%) ל- 10 µL של הדגימה). הערה: ניתן לאחסן דגימות ב-20°C-20 °C בשלב זה למשך פרק זמן ממושך לשימוש מאוחר יותר.
   4. הכינו סטנדרטים של HIV-1 באמצעות ביצוע דילול סדרתי פי 2 (עם ריכוז התחלתי של 5 ng/mL).
   5. דללו דגימות רכזות (ממלאי מלאי שדוללו מראש ביחס של 1:100) ב-RPMI 1640 (מדיום Roswell Park Memorial Institute 1640) בתוספת 0.2% Tween 20 ו-1% BSA כדי להכין דלילות של 1:10,000, 1:50,000 ו-1:250,000. דללו דגימות שאינן רכזות (ממלאי מלאי שדוללו מראש ביחס של 1:10) ב-RPMI 1640 בתוספת 0.2% Tween 20 ו-1% BSA כדי להכין דלילות של 1:500, 1:2500 ו-1:12,500.
   6. העבירו את הדגימות לפלטה בשלוש חזרות (triplicates) והדגירו למשך לילה ב- 4 °C.
   7. ביום למחרת, שטפו את הבארות שש פעמים והדגירו ב- 37 °C במשך 4 שעות עם 100 µL נוגדן פוליקלונלי נגד p24 מארנב, מדולל ביחס של 1:1000 ב-RPMI 1640, 10% FBS, 0.25% BSA ו-2% סרום עכבר נורמלי (NMS).
   8. שטוף שש פעמים כפי שפורט לעיל והדגר ב- 37 °C במשך שעה אחת עם goat anti-rabbit horseradish peroxidase IgG בדילול של 1:10,000 בתוך RPMI 1640 המועשר ב-5% סרום עיזים נורמלי, 2% NMS, 0.25% BSA ו-0.01% Tween 20.
   9. שטוף את הפלטה, כפי שפורט לעיל, והדגר עם TMB (3,3′,5,5′סובסטרט פראוקסידאז TMB (3,3′,5,5′-Tetramethylbenzidine) בטמפרטורת החדר למשך 15 דקות.
   10. עצרו את התגובה על ידי הוספה של 100 µL של 1 N HCL. מדוד את בליעת הדגימה באורך גל של 450 ננומטר באמצעות קורא פלטות לבליעה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה

שם	חברה	מספר קטלוג	הערות
ריאגנטים ל-p24 ELISA
נוגדן מונוקלונלי נגד p24	תוכנית הריאגנטים לייחוס ולמחקר של ה-NIH עבור AIDS	3537
סטנדרטים של HIV-1	תוכנית הריאגנטים למחקר ולהפניה של NIH AIDS	SP968F
נוגדן פוליקלונלי של ארנב נגד p24	תוכנית המחקר וריאגנטים לייחוס עבור AIDS של ה-NIH	SP451T
נוגדן IgG של עיזים נגד ארנב המסומן בחזרת חזרת (horseradish peroxidase)	Sigma Aldrich	12-348	ריכוז עבודה 1:1500
סרום עכבר נורמלי, סטרילי, 500 מ"ל	Equitech-Bio	SM30-0500
סרום עיזים, סטרילי, 10 מ"ל	Sigma	G9023	ריכוז עבודה 1:1000
מצע תסס (סובסטרט) פראוקסידאז TMB (3,3′,5,5′-Tetramethylbenzidine)	KPL	5120-0076	ריכוז עבודה 1:10,000