ייצור של נגיף אדנו-אסוסיאטיבי רקומביננטי באמצעות טרנספקציית פלסמידים

תקציר

טרנספקציה של תאי HEK293 עם פלסמידים של וירוס אדנו-אסוסיאטיבי רקומביננטי 9 (rAAV9) הכן תמיסת פוליאתילנימין (PEI) ליניארי בריכוז 1 µg/µl. המס אבקת PEI במים מזוקקים (dH2O) נטולי אנדוטוקסינים שחוממו ל-70-80 °C. לאחר קירור לטמפרטורת החדר (RT), נטרל את התמיסה ל-pH 7.0 באמצעות 1 M HCl. בצע סטריליזציה של התמיסה באמצעות סינון (0.22 µm). חלק את תמיסת המלאי של PEI בריכוז 1 µg/µl לאליקוטים (1,400 µl למבחנה) ואחסן את התמיסה ב-20 °C-. תרבל תאי HEK293 במצע Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) עם 10% סרום עגל עדתי (FBS) ו-1% פניצילין/סטרפטומייצין. תרבל את התאים באינקובטור בטמפרטורה של 37 °C עם 5 ± 0.5% פחמן דו-חמצני (CO2). ביום 0, זרע תאי HEK293 בעשר צלחות של 150 מ"מ, 18-20 שעות לפני הטרנספקציה, על ידי פיצול של תאים שהגיעו ל-90% קונפלואנציה (confluence) בדילול של 1:2. הערה: ביום 1, התאים צריכים להגיע ל-90% קונפלואנציה. ביום 1, בצע טרנספקציה לתאי HEK293 עם פלסמיד rAAV9 (למשל, מבני rAAV9.cTNT::GFP או rAAV6.U6::shRNA), פלסמיד Ad-Helper ופלסמיד AAV-Rep/Cap באמצעות PEI. עבור 10 צלחות של תאים ב-90% קונפלואנציה, ערבב 70 µg של פלסמיד AAV-Rep/Cap, 70 µg של פלסמיד rAAV9 ו-200 µg של פלסמיד Ad-Helper במבחנה לצנטריפוגה של 50 מ"ל. אם התאים פחות קונפלואנטיים, התאם את כמות ה-DNA באופן פרופורציונלי. לדוגמה, אם התאים נמצאים ב-75% קונפלואנציה, הפחת את כמות ה-DNA באופן פרופורציונלי (75/90 מהכמות המופיעה בשלב 1.4.1): ערבב 70 x 75/90 = 58.3 µg של פלסמיד AAV-Rep/Cap, 70 x 75/90 = 58.3 µg של פלסמיד rAAV9 ו-200 x 75/90 = 166.7 µg של פלסמיד Ad-Helper במבחנה לצנטריפוגה של 50 מ"ל. הוסף 49 מ"ל של DMEM בטמפרטורת החדר (ללא FBS) למבחנה של ה-50 מ"ל וערבב היטב. הוסף 1,360 µl של תמיסת PEI כדי להגיע ליחס של PEI:DNA (נפח/משקל) של 4:1. ערבב היטב. הדגר בטמפרטורת החדר למשך 15-30 דקות. הוסף 5 מ"ל מהתערובת שהוכנה בשלב 1.4.4 לכל צלחת של 150 מ"מ (50 מ"ל מהתערובת עבור עשר צלחות של 150 מ"מ). תרבל את התאים באינקובטור בטמפרטורה של 37 °C עם 5 ± 0.5% CO2 למשך 60-72 שעות. דינג, ג'. , וכ')הכנת rAAV9 לביטוי יתר או להשתקה של גנים בלבבות של עכברים. J. Vis. Exp. (2016)

סרטון זה מדגים את ייצור חלקיקי נגיף adeno-associated recombinant (rAAV) באמצעות טרנספקציית פלסמידים בתאים של יונקים. הוא מדגיש את הביטוי המתואם של חלבוני Rep, Cap וחלבוני helper המניעים את השכפול של הגנום הנגיפי ואת הרכבת הקפסיד בתוך הגרעין.

פרוטוקול

1. טרנספקציית תאי HEK293 עם פלסמידים של נגיף אדנו-אסוסיאטיבי רקומביננטי 9 (rAAV9)

1. הכן 1 µg/µl של תמיסת פוליאתילנימין (PEI) ליניארי. המיס את אבקת ה-PEI ב-dH2O נטול אנדוטוקסינים₂שחומם ל-70-80 °Cלאחר קירור לטמפרטורת החדר (RT), יש לנטרל את התמיסה ל-pH 7.0 באמצעות HCl בריכוז 1 M. יש לבצע סטריליזציה באמצעות סינון (0.22 µmאת התמיסה. חלק למקבצים את 1 µg/µl תמיסת מנתק PEI (1,400 µl/tube) ואחסן את התמיסה בטמפרטורה של -20 °C.
2. תרבת תאי HEK293 במצע Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) עם 10% סרום עגל עוברי (FBS) ו-1% פניצילין/סטרפטומייצין. תרבת את התאים ב- 37 °C אינקובטור עם 5 ± 0.5% פחמן דו-חמצני (CO2)₂).
3. ביום 0, 18–20 שעות לפני הטרנספקציה, יש לזרוע תאי HEK293 בעשר צלחונות של 150 מ"מ על ידי פיצול של > תאים בהסתמיות (confluence) של 90% בדילול של 1:2.
   הערה: ביום 1, התאים צריכים להגיע למסף של 90% קונפלואנס (confluence).
4. ביום 1, בצע טרנספקציה לתאי HEK293 עם פלסמיד rAAV9 (למשל, מבני rAAV9.cTNT::GFP או rAAV6.U6::shRNA), פלסמיד Ad-Helper ופלסמיד AAV-Rep/Cap באמצעות PEI.
   1. עבור 10 צלחות של תאים ב-90% התלכדות (confluence), ערבב 70 µg של פלסמיד AAV-Rep/Cap, 70 µg של פלסמיד rAAV9, ו- 200 µg של פלסמיד Ad-Helper בתוך מבחנת צנטריפוגה של 50 מ"ל.
   2. אם התאים פחות צפופים (less confluent), התאימו את כמות ה-DNA באופן יחסי. לדוגמה, אם התאים נמצאים ברמת צפיפות של 75%, הפחיתו את כמות ה-DNA באופן יחסי (75/90 מהכמות המצוינת בשלב 1.4.1): ערבבו 70 x 75/90 = 58.3 µg של פלסמיד AAV-Rep/Cap, ‏70 x 75/90 = 58.3 µg של פלסמיד rAAV9, ו-200 x 75/90 = 166.7 µg של פלסמיד Ad-Helper בתוך מבחנה לצנטריפוגה בנפח 50 מ"ל.
   3. הוסיפו 49 מ"ל של DMEM בטמפרטורת החדר (ללא FBS) לשפופרת ה-50 מ"ל וערבבו היטב.
   4. הוסף 1,360 µl של תמיסת PEI כדי להגיע ליחס PEI:DNA (נפח/משקל) של 4:1. ערבבו היטב. הדגירו בטמפרטורת החדר למשך 15-30 דקות.
   5. הוסיפו 5 מ"ל מהתערובת שהוכנה בשלב 1.4.4 לכל צלחת של 150 מ"מ (50 מ"ל מהתערובת עבור עשר צלחות של 150 מ"מ).
5. תרב את התאים ב- 37 °C אינקובטור עם 5 ±0.5% CO2₂ למשך 60–72 שעות.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה

שם	חברה	מספר קטלוג	הערות
Polyethylenimine, ליניארי (MW 25,000)	Polysciences, Inc.	#23966-2
מבחנה, פוליפרופילן, 36.2 ml, 25 x 87 mm, (כמות: 56)	Beckman Coulter, Inc	# 362183
תווך DMEM	Fisher Scientific	SH30243FS
סרום עגל עוברי (FBS)	Atlanta Biologicals	S11150
וקטור rAAV9	Penn Vector Core	P1967