טיהור חלקיקי נגיף רקומביננטיים מתאי כליה אנושיים שעברו טרנספקציה

תקציר

מקור: Ding, J. et. al., הכנת rAAV9 לביטוי יתר או השתקה של גנים בלבבות עכברים. J. Vis. Exp. (2016)

סרטון זה מציג את טהרתם של חלקי נגיף רקומביננטיים מתאי כליה אנושיים שעברו טרנספקציה. הנגיף משתחרר על ידי ליזיס בהקפאה והפשרה ומטוהר באמצעות מדרגי יודיקסנול עם סינון בסיוע פולימר בלוק-קופולימר.

פרוטוקול

1. טרנספקציה של תאי HEK293 עם פלסמידים של וירוס אדנו-אסוסיאטיבי רקומביננטי 9 (rAAV9)
   1. הכנה 1 µg/µl של תמיסת פוליאתילנאימין (PEI) ליניארי. המסס את אבקת ה-PEI ב-dH2O נקי מאנדוטוקסינים₂שחומם ל-70-80 °Cלאחר קירור לטמפרטורת החדר (RT), נטרלו את התמיסה ל-pH 7.0 באמצעות חומצה כלורידית (HCl) בריכוז 1 M. בצעו סטריליזציה באמצעות סינון (0.22 µm) את התמיסה. חלק את ה- 1 µg/µl תמיסת מלאי של PEI (1,400 µl/tube) ואחסן את התמיסה בטמפרטורה של -20 °C.
   2. טפחו תאי HEK293 במצע Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) עם 10% סרום בקר עוברי (FBS) ו-1% פניצילין/סטרפטומיצין. טפחו את התאים ב- 37 °C אינקובטור עם 5% ± 0.5% פחמן דו-חמצני (CO₂).
   3. ביום 0, זרעו תאי HEK293 בעשר צלחות בקוטר 150 מ"מ, 18–20 שעות לפני התספיקציה (transfection), באמצעות פיצול (splitting) > תאים בהסמיכות (confluence) של 90% בדילול של 1:2.
      הערה: ביום הראשון, התאים צריכים להגיע ל-90% התמזגות (confluence).
   4. ביום הראשון, בצעו טרנספקציה לתאי HEK293 עם הפלסמיד rAAV9 (למשל, מבני rAAV9.cTNT::GFP או rAAV6.U6::shRNA), פלסמיד Ad-Helper ופלסמיד AAV-Rep/Cap באמצעות PEI.
      1. עבור 10 צלחות של תאים בהסנפנות (confluence) של 90%, ערב 70 µg של פלסמיד AAV-Rep/Cap, 70 µg פלסמיד pfrAAV9, ו- 200 µg של פלסמיד Ad-helper בתוך מבחנה לצנטריפוגה בנפח של 50 מ"ל.
      2. אם התאים פחות צפופים (confluent), התאימו את כמות ה-DNA באופן יחסי. לדוגמה, אם התאים נמצאים ב-75% צפיפות, הפחיתו את כמות ה-DNA באופן יחסי (75/90 מהכמות המצוינת בשלב 2.4.1): ערבבו 70 x 75/90 = 58.3 µg של פלסמיד AAV-Rep/Cap, 70 x 75/90 = 58.3 µg של פלסמיד rAAV9, ו-20 x 75/90 = 166.7 µg של פלסמיד Ad-Helper במבחנת צנטריפוגה בנפח 50 מ"ל.
      3. הוסיפו 49 מ"ל של DMEM בטמפרטורת החדר (ללא FBS) לשפור של 50 מ"ל וערבבו היטב.
      4. הוסף 1,360 µl של תמיסת PEI כדי להגיע ליחס PEI:DNA (v/w) של 4:1. ערבבו היטב. דגרו בטמפרטורת החדר למשך 15–30 דקות.
      5. הוסיפו 5 מ"ל מהתערובת שהוכנה בשלב 1.4.4 לכל צלחת בקוטר 150 מ"מ (50 מ"ל מהתערובת עבור עשר צלחות בקוטר 150 מ"מ).
   5. תרבתו את התאים ב- 37 °C אינקובטור עם 5% ±0.5% CO₂ למשך 60–72 שעות.
2. קציר של תאי HEK293 שעברו טרנספקציה וטיהור של וקטורי rAAV9
   1. קצרו את התאים 60–72 שעות לאחר ההטרנזפקציה. השחררו והשעיו את התאים שבצלחונות על ידי פיפטינג (pipetting) מעלה ומטה עם מצע התרבית. העבירו את כל תרחיפי התאים לפרועות ( tubes) סטריליות בנפח 50 מ"ל.
   2. סבבו את התאים בצנטריפוגה במהירות של 50 x g למשך 5 דקות. השתה את משקע התאים ב-5 מ"ל של סלקוציה פוספטית (PBS) בכל מבחנה, ואחדו את כל תלואי התאים למבחנה אחת בנפח של 50 מ"ל.
   3. סובב את התאים בצנטריפוגה ב-50 x g למשך 5 דקות. השלך את העילאי. בשלב זה, שמור את משקע התאים ב-80 °C או לטהר באופן מיידי את ה-AAV מהמשקע, כפי שמתואר בשלבים 2.4-2.15.
   4. הכינו את באפר הליסיס: 150 mM נתרן כלוריד (NaCl) ו-20 mM Tris(hydroxymethyl)aminomethane Hydrochloride (Tris-HCl, pH 8.0). סטריליזציה באמצעות סינון (0.22 µM. אחסן את התמיס ב- 4 °C.
   5. שחזר את המשקע (pellet) ב-10 מ"ל של תמיסת ליזיס.
   6. הקפיאו את התמצית בטמפרטורה של -80 °C או באמבט של קרח יבש/אתנול, ולאחר מכן להמיס בטמפרטורה של 37 °Cסובב במערבל (Vortex) למשך דקה אחת. הקפא והפשר את הליזאט 3 פעמים.
   7. הוסף מגנזיום כלוריד (MgCl2₂) תמיסה אל הליזט שהופשר (הגעי לריכוז סופי של MgCl₂ בליסאט יהיה 1 mM). הוסף את הנוקליאז עד לריכוז סופי של 250 U/ml. הדגר ב- 37 °C במשך 15 דקות כדי להמיס את הצבר של ה-DNA/חלבון.
      הערה: אם השקיעות של ה-DNA/חלבון אינה מתמוססת לאחר טיפול בנוקליאז או בנוקליאז פנימי (endonuclease), בצעו הומוגניזציה של הליסאטים בעזרת הומוגניזטור דאנס (Dounce homogenizer) במשך 20 פעמים.
   8. סבבו את הדגימה בצנטריפוגה במהירות של 4,80 x g למשך 20 דקות ב- 4 °Cאספו את העל-נוזל (supernatant).
   9. בינתיים, הכינו את תמיסות מדרג ה-Iodixanol:
      1. הכינו 17% מתמיס הגרדיאנט על ידי ערבוב של 5 מ"ל של 10x PBS, 0.05 מ"ל של 1 M MgCl2₂, 0.125 מ"ל של אשלגן כלוריד (KCl) בריכוז 1 M, 10 מ"ל של NaCl בריכוז 5 M, ו-12.5 מ"ל של מצע למדרג צפיפות. התאימו את הנפח הכולל ל-50 מ"ל באמצעות H₂.O
      2. הכינו את התמיסה בריכוז 25% על ידי ערבוב של 5 מ"ל של PBS בריכוז 10x ו-0.05 מ"ל של MgCl₂ בריכוז 1 M₂, 0.125 מ"ל של KCl בריכוז 1 M, 20 מ"ל של תווך למדרג צפיפות, ו-0.2 מ"ל של Phenol Red בריכוז 0.5% (משקל/נפח). התאימו את הנפח הכולל ל-50 מ"ל באמצעות H₂O.
      3. הכינו את התמיסה בריכוז 40% על ידי ערבוב של 5 מ"ל של PBS בריכוז 10x ו-0.05 מ"ל של MgCl₂ בריכוז 1M₂, 0.125 מ"ל של KCl בריכוז 1 M, ו-3.3 מ"ל של תמיסת מדרג צפיפות. התאימו את הנפח הכולל ל-50 מ"ל באמצעות H₂O.
      4. הכינו את התמיסה בריכוז 60% על ידי ערבוב של 0.05 מ"ל של MgCl2 בריכוז 1 M₂, 0.125 מ"ל של KCl בריכוז 1 M, 50 מ"ל של מדיום למדרג צפיפות, ו-0.1 מ"ל של Phenol Red בריכוז 0.5% (משקל/נפח).
   10. באמצעות מחט ומזרק, טענו את תמיסות מדרג האיודיקסנול (Iodixanol) לתוך מבחנה הפוליפרופילן בסדר הבא, החל מהתחתית: 5 מ"ל של 17%, 5 מ"ל של 25%, 5 מ"ל של 40% ו-5 מ"ל של 60%. טענו את כל הליזאט שהתקבל משלב 3.8 (14–16 מ"ל) מעל המדרג. המדרג, מהתחתית למעלה, מורכב מ-60%, 40%, 25%, 17%, ושכבת הליזאט. מלאו את המבחנה בתמיסת ליזיס (lysis buffer) וכסו אותה בפק.
   11. סבבו בצנטריפוגה ב-185,0 x g למשך 90 דקות ב- 16 °C.
   12. אספו את הפракציה הוויראלית (שכבת ה-40%) באמצעות מזרק. הכניסו את המחט (בגודל 21 gauge) לנקודת המפגש בין פראקציות ה-40% וה-60%, ושאבו אך ורק את שכבת ה-40%.
       הערה: הימנעו משאיבת השכבה של ה-25%.
   13. ערבבו את פракציית הווירוס עם תמיסת PBS של פוליאוקסיאתילן-פוליאוקסיפרופילן בלוק-קו-פולימר סטרילית (מלאי של 10% פוליאוקסיאתילן-פוליאוקסיפרופילן בלוק-קו-פולימר, מדולל ב-PBS ביחס של 1:10,00), עד לנפח כולל של 15 מ"ל. העמיסו את התערובת לתוך צינור הסינון (סף חיתוך של משקל מולקולרי = 10 kD). סבבו בצנטריפוגה במהירות של 2,0 x g למשך 30 דקות ב- 4 °C.
   14. שפכו את התמיסה שבתחתית. מלאו מחדש את צינור הסינון בתמיסת PBS עם קו-פולימר של פולי-אוקסיתילן-פולי-פרופילן עד לנפח כולל של 15 מ"ל. סבבו בצנטריפוגה ב-2,0 x g למשך 20 דקות ב- 4 °Cחזרו על שלב זה פעמיים נוספות. אספו את נגיפי ה-rAAV9 המטוהרים (הפракציה שמעל המסנן).
   15. העבירו את rAAV9 המופק שבמבחנה עם המסנן למבחנות בנפח 1.7 מ"ל. חלקו את rAAV9 המופק למנות (10- 400 µl/tube, בהתאם לנפח ולטיטר של ה-AAV) ואחסן את הווירוס ב-80 °C.
       הערה: יש להימנע ממספרי הקפאה והפשרה חוזרים.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה

שם	חברה	מספר קטלוג	הערות
פוליאתילנימין, ליניארי (MW 25,0)	Polysciences, Inc.	#23966-2
מבחנה, פוליפרופילן, 36.2 מ"ל, 25 x 87 מ"מ, (כמות: 56)	Beckman Coulter, Inc	# 362183
נוקלאז, בדרגת טיהור גבוהה (ultrapure)	SIGMA	#E8263-25KU
מדיום למדרג צפיפות (Iodixanol)	SIGMA	#D1556-250ML
יחידת סינון צנטריפוגית עם ממבנה Ultracel-10	EMD Millipore Corporation	#UFC9108
מחט פיפטה למעבדה עם 90° קצוות תומבים, ג'אג' (gauge) 14, אורך 6 אינץ', תושבת מצופה ניקל	SIGMA	#CAD7942-12EA
תמיסת Poloxamer 18 (Pluronic® תמיסת F-68)	SIGMA	P56-10ML
Proteinase K	SIGMA	3115828001
DNase I	Roche	10104159001
מכשיר צנטריפוגה	Thermo Scientific	75004260
מערכת צנטריפוגה	Beckman Coulter	363118
ולטרה-צנטריפוגה	Beckman Coulter
מדיום DMEM	Fisher Scientific	SH30243FS
סרום עגל עוברי	Atlanta Biologicals	S150
וקטור rAAV9	Penn Vector Core	P1967