קביעת פיזור של RNA ויראלי בתאי מאכסן באמצעות היברידיזציה פלואורסצנטית באתר (Fluorescence In Situ Hybridization)

תקציר

מקור: Vallery, T. K. & Steitz, J. A. היברידיזציה פלורסצנטית באתר (FISH) כמותית ואימונופלורסצנציה (IF) של תוצרי גנים ספציפיים בתאים נגועי KSHV. .J. Vis. Exp (2019)

סרטון זה מדגים היברידיזציה פלואורסצנטית באתר (FISH) להדמיית RNA ויראלי בתאים נגועים בנגיף. הוא מפרט את השלבים הכרוכים בהיברידיזציה של גששים, הגברה של האות והדמיה קונפוקלית.

פרוטוקול

1. קיבוע, היברידיזציה וויזואליזציה של RNA נגיפי

1. הסיר את המצע ואת עודפי התאים. לאורך פרוטוקול זה, השתמש בשאיבת ואקום להסרת תמיסות ובפיפטור עדין להוספת תמיסות.
   הערה: ניתן להפחית את עוצמת הוואקום על ידי הנחת קצה של מיקרופיפטה של 200 µL מעל פיפטת פסטור מזכוכית. החלף את קצה המיקרופיפטה בין שלבי השטיפה כדי למנוע זיהום. יש לבצע כל שלב שטיפה במהירות, שכן קריטי שהתאים לא יתייבשו.
2. קבע מיד את התאים עם 4% formaldehyde/PBS (סליין עם בופר פוספט) מקורר מראש על קרח למשך 30 דקות. שטוף את התאים שלוש פעמים עם 200 µL של 1x PBS מקורר ל-4 °C והדגס למשך 5 דקות בטמפרטורת החדר או על קרח.
   1. בצע פרמיאביליזציה לתאים המקובעים עם 200 µL של 0.5% Triton-X/PBS מקורר מראש למשך 10 דקות על קרח, או עם 750 µL של 70% אתנול מקורר מראש ב-4 °C למשך שעה אחת (מינימום) עד 7 ימים (מקסימום).
      הערה: כל השטיפות לאורך פרוטוקול זה מבוצעות באותו אופן, אלא אם צוין אחרת. אתנול 70% מרחף את הדבק בין התאים לסלייד, מה שמקל על ההפרדה מאוחר יותר, ומספק גם הפסקה משמעותית בפרוטוקול. עם זאת, השתמש בסרט פאראפין סביב סלייד התאים כדי להפחית אידוי ובדוק את מפלס האתנול בכל תא בערך כל 8 שעות. אתנול 70% גם משטיח את התאים, מה שיוצר תמונה חדה יותר, בעוד ש-Triton-X אינו מייבש את התאים ואינו משנה את ממדי התא.
3. הסר את התאים בזהירות כדי למנוע סדקים בסלייד.
   הערה: השתמש במכשיר הסרה חדש או בכזה עם מעט מאוד שאריות דבק שסופק על ידי היצרן, ושחרר בעדינות את התאים כדי למנוע מהסלייד להיסדק. שימוש ב-70% אתנול כחומר לפרמיאביליזציה למשך 4 שעות מפחית מאוד את הסבירות לסדקים. במקרה של סדק, המשך בפרוטוקול בתאים שלא הושפעו מהסדק והיה מודע לקצב החמצון הגבוה יותר של סליידים שאינם אטומים כהלכה (כלומר, חיי אחסון קצרים יותר).
4. שטוף את התאים עם 2x SSC (סליין סודיום ציטראט) פעם אחת ולאחר מכן מרח 45 µL של תמיסת היברידיזציה המורכבת מ-50% פורממיד, 10% דקסטראן סולפט, 2x SSC, 0.1% אלבומין סרום בקר (BSA), 500 µg/mL DNA של זרע סלמון, 125 µg/mL tRNA של E. coli, ו-1 mM של קומפלקסים של vanadyl ribonucleoside. הדגס למשך שעה אחת ב-37 °C בתא לחות, שיכול להיות צלחת פטרי של 150 mm עם מגבונים סטריליים לחים.
   הערה: הכן תמיסת היברידיזציה טרייה לפחות שעה לפני השימוש. המס תחילה את הדקסטראן סולפט במים, תוך ערבוב תכוף ב-vortex והדגסה באמבט מים של 37 °C.
5. חשב את כמות האוליגנוקלאוטידים הדרושה להשגת הריכוז המומלץ של 25 µM ב-35 µL של תמיסת היברידיזציה לכל תא. התאם את ריכוז האוליגנוקלאוטיד ה-anti-sense לפי הצורך. הוסף מים מזוקקים לאוליגנוקלאוטידים כדי להביא את נפח הדנטורציה ל-10 µL.
   הערה: לאחר תגובת הסימון, האוליגנוקלאוטידים נשמרים בתמיסת quenching המכילה 0.18 M potassium cacodylate, 23 mM Tris-HCl, 0.23 mg/mL BSA, 4.5 mM CoCl₂, 18 mM ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA), 2.7 mM potassium phosphate, ו-6.8 mM KCl, 45 µM 2-Mercaptoethanol, 0.02% Triton X-100, ו-2% גליצרין. הריכוזים גבוהים מספיק כך שדילול במים יביא את תמיסת הדנטורציה לריכוזים קרובים ל-1x TE (10 mM Tris-HCl ו-1 mM EDTA), בופר דנטורציה סטנדרטי לאוליגנוקלאוטידים.
6. בצע דנטורציה לאוליגנוקלאוטידים המסומנים ב-digoxigenin (DIG) ו/או Alexa Fluor 594 ב-95 °C למשך 5 דקות. לאחר מכן הוסף 35 µL של תמיסת היברידיזציה טרייה לכל תא מיועד אל האוליגנוקלאוטידים שעברו דנטורציה. אם מבצעים double fluorescence in situ hybridization (FISH), ניתן לבצע דנטורציה והיברידיזציה לשתי קבוצות של אוליגנוקלאוטידים anti-sense יחד.
7. הסר את תמיסת טרום-ההיברידיזציה ולאחר מכן הוסף לתאים את תמיסת ההיברידיזציה המכילה את האוליגנוקלאוטידים המסומנים. הדגס למשך הלילה בתא הלחות ב-37 °C עם נייר אלומיניום כדי להגן על האוליגנוקלאוטידים המסומנים בפלואורופור.
   הערה: ההדגסה צריכה להיות לפחות 10 שעות ולא יותר מ-24 שעות.
8. למחרת, שטוף את התאים פעמיים עם 2x SSC למשך 10 דקות ב-37 °C ולאחר מכן פעמיים עם 1x SSC למשך 10 דקות ב-25 °C.
9. קבע את התאים עם 4% formaldehyde/1x PBS מקורר מראש למשך 10-15 דקות על קרח. לאחר מכן שטוף את התאים עם PBS שלוש פעמים ובצע פרמיאביליזציה למשך שעה אחת עם 70% אתנול מקורר מראש או למשך 10 דקות עם 0.5% Triton-X/1x PBS מקורר מראש ב-4 °C.
10. הדגס את התאים עם 1:200 anti-digoxigenin (DIG)–fluorescein isothiocyanate (FITC) ב-0.1% BSA/1x PBS מקורר מראש למשך שעה אחת ב-4 °C. הסר את תמיסת הנוגדנים ושטוף שלוש פעמים עם 1x PBS.
11. קבע עם 4% formaldehyde/1x PBS מקורר מראש למשך 10-15 דקות ב-4 °C ולאחר מכן שטוף שלוש פעמים עם 1x PBS.
12. הדגס את התאים עם 0.4 µg/mL 4′,6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) ב-0.5% Triton-X/1x PBS מקורר מראש למשך 15 דקות על קרח ולאחר מכן שטוף שלוש פעמים עם 1x PBS.
13. הצמד את הסליידים עם חרוזי פלואורסצנציה (אופציונלי) ותווך הצמדה (mounting medium). לאחר מכן אטום את כיסוי הזכוכית לסלייד באמצעות לק שקוף.
14. באמצעות מיקרוסקופ קונפוקאלי, אסוף תמונות של הדגימות בטווח של שעה עד שבוע לאחר ביצוע הפרוטוקול בהגדלה של 630x. מרח מספר שכבות של לק כדי לאטום את כיסוי הזכוכית ולהאריך את חיי הפלואורופור על ידי הפחתת קצב החמצון.
    הערה: אין להשתמש בתווך הצמדה המכיל DAPI. בעת איסוף התמונות, כלול את סרגל הקנה (scale bar) בכל תמונה לצורך כימות מאוחר יותר. חרוזי פלואורסצנציה משמשים כביקורת לעצימות הפלואורסצנציה בין סליידים והכנות דגימות. רכוש תמונות בחלק המרכזי של התא לצורך כימות דו-ממדי (2D).

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה

שם	חברה	מספר קטלוג	הערות
Anti-DIG FITC	Jackson Lab Immunologicals	200-092-156
Dextran sulfate	Sigma Aldrich	D8906	בדרגת ביולוגיה מולקולרית
DIG-oligonucleotide tailing kit	Sigma Roche	#03353583910	דור שני
שקופיות בעלות שמונה תאים	Nunc Lab Tek II	#154453	איטום כחול המעלה את המתח הפשטי, אך קיימת גם אפשרות להפרדה באמצעות ג'ל שקוף.
Formamide	Sigma Aldrich	F9037	בדרגת ביולוגיה מולקולרית
Vanadyl ribonucleoside complexes	NEB	S1402S