מדידת השראה ספונטנית של פאגים בחיידקים ליסוגניים לאורך זמן

תקציר

מקור: .Krishnamurthi, R ועוד. הבנת ההשפעה של בקטריופאגים מיתונים על הליסוגנים שלהם באמצעות טרנסקריפטומיקה. J. Vis. Exp. (2024).

סרטון זה מדגים את הספירה הזמנית של השראה ספונטנית של פאגים ב- Pseudomonas aeruginosa ליסוגני, באמצעות כימות תאי חיידקים חיים (CFUs) וחלקיקי פאג זיהומיים (PFUs) לאורך זמן. על ידי דגימה במרווחי זמן מוגדרים במהלך הגדילה וניתוח של היווצרות מושבות ופלאקים, השיטה חושפת מתי ההשראה הספונטנית היא מינימלית. דבר זה מאפשר זיהוי של נקודות זמן אופטימליות לניתוח טרנסקריפטומי המשכי עם הפרעה ליטית מינימלית.

פרוטוקול

1. ספירה ישירה זמנית של השראה ספונטנית (איור 1)

1. הכינו תרביות התחלה ללילה של הליסוגן (למשל, ליסוגן של P. aeruginosa PAO1 הנושא פאג'ים מסוג LES (בקטריופאגים של Liverpool Epidemic Strain (LES))) ושל המאחס האינדיקטור (PAO1-Rif^R(עמיד לריפמפיצין Pseudomonas aeruginosa PAO1) על ידי הזרקת מושבה בודדת ל-5 מ"ל של LB (מצע Luria–Bertani), והדגרה ב- 37 °C בניעור במהירות של 180 סבב לדקה (18–24 שעות).
2. הכינו תרביות רעננות של הליסוגן ומארח האינדיקטור על ידי הזרקת התרביות מהלילה ב-100 מ"ל של LB ביחס של 1:100, ודגרו ב- 37 °C עם ניעור (180 rpm).
   1. עקבו אחר צמיחת הליסוגן על ידי מדידת ה-OD₆₀₀ וספירת תאים חיוניים באמצעות שיטת Miles Misra. לשם כך, אספו דגימה של 1 מ"ל מכל תרבית ליסוגן בכל שעה, החל מרגע ההכנסה, למשך 8 שעות.
   2. בצעו דילול סדרתי של הדגימה מיד לאחר האיסוף על ידי הוספה של 100 µL של הדגימה לתוך 900 µL של המצע המתאים. ערבבו היטב במכשיר וורטקס (Vortex) במהירות המקסימלית, השליכו את הטיפ בכל דילול, והמשיכו את סדרת הדילולים מ-10⁻¹ עד 10⁻⁹.
   3. טפטוף 10 µL של הדילוציות הנדרשות בשלוש חזרות על צלחת LB אגר, המתינו לייבוש, ודגרו ב- 37 °C במשך 18–24 שעות.

   4. כדי לחשב את מספר התאי הבקטריאליים החיים, מצאו דילול שבו מספר המושבות ניתן לספירה בקלות. ספרו את מספר המושבות בכל נקודה (spot), ולאחר מכן השתמשו בנוסחה הבאה:
       

      

      
      הערה: עם גדילת תרבית הליסוגן, ייווצרו חלקיקי פאג פעילים כתוצאה מהשראה ספונטנית. ייצורם של פאגים זיהומיים פירושו שטרנסקריפטום אוכלוסיית הליסוגן מזוהם כעת בביטוי גנים הקשור למחזור השכפול הליטי, הנובע מאות השכפול הליטי של הפאג ומתגובת תא המאחסן התואמת. לפיכך, חשוב לזהות את שלב הגדילה שבו היחס בין תאים ליסוגניים לחלקיקי פאג זיהומיים חופשיים הוא הגבוה ביותר, וזאת כדי להגביל ככל האפשר את רעש התמלול ברקע (הנוצר על ידי טרנסקריפטום הפאג הליטי) בתוך מערך הנתונים.

3. כדי לספור את חלקיקי הפאג הזיהומיים בכל דגימה זמנית, החדר (inoculate) ל-5 מ"ל של אגר בקטריולוגי סטרילי בריכוז 0.4% ב-LB (top agar) את 100 µL של מארח אינדיקטור בשלב אקספוננציאלי בינוני (OD600: 0.4–0.5; במקרה זה, PAO1-RifR)^R) בנוכחות של חומר ברירה מתאים (50 µg·מ"ל⁻¹ ריפמפיצין במקרה זה, כיוון שה-MIC של מאחס ה-PAO1 הוא רק 16 µg·מ"ל⁻¹)
   1. טפטף 10 µL של אותה סדרת דילול (ראה שלב 1.2.2) על שכבת ה-top agar המוחדרת, והמתן לייבוש לפני הדגרה ב- 37 °C למשך 18–24 שעות.

   2. לחישוב מספר חלקיקי הפאג הזיהומיים, מצאו דילול בעל פלאקים שניתן לספור בקלות. ספרו את מספר הפלאקים בכל נקודה.
       

      

   3. מצא את הזמן/התנאי שבהם האינדוקציה הספונטנית ל-CFU (יחידה יוצרת מושבה) היא מינימלית, לצורך השלבים הניסיוניים הבאים.

תוצאות

איור 1: הניסוי למניית ה-PFU וה-CFU של ליסוגן מאותה דגימה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה

שם	חברה	מספר קטלוג	הערות
PAO1		6
LESB58		6
LES phages	הודו וטוהרו מ-LESB58 באמצעות Norfloxacin.
Lysogeny Broth (LB)	Merck	1.10285.500
LB Agar	Merck	1.10283.500
Agar Agar	Fisher	A/1080/53
Top Agar	0.4 g Agar Agar + 2.5 g LB Broth ב-100 mL מים; לעקר באוטוקלאב ולהשתמש.	-
Rifampicin	Sigma (מלאי: 50 mg/mL ב-Methanol - לערבב היטב ולהשתמש במסנן 0.22µm לסטריליזציה ולאחסון ב-20°C- עד לשימוש)	R3501