השראה של שכפול ליטי של פרופאג' לצורך אנליזה טרנסקריפטומית

תקציר

מקור: Krishnamurthi, R., ואחריםהבנת ההשפעה של בקטריופאגים מתונים על הליסוגנים שלהם באמצעות טרנסקריפטומיקה. J. Vis. Exp. (2024)

סרטון זה מדגים את השראת השכפול הליטי של פרופאג המשולב בגנום החיידקי ואת לכידת השינויים בביטוי הגנים באמצעות דגימה מתוזמנת לצורך אנליזה טרנסקריפטומית.

פרוטוקול

1. הכנת תרביות ליסוגן שאינן מושראות ותרביות מושראות להפקת RNA (חומצה ריבנוקלאית)

1. הכינו תרבית לילה רעננה על ידיe-inoculation של מושבה בודדת של הליסוגן ל-5 mL של LB, ודגרו ב-37 °C עם ניעור (180 rpm (סל"ד)) למשך 18–24 שעות.
2. בצעו תת-תרבית (Subculture) לתרבית הלילה ב-80 mL של LB (Lysogeny broth) ביחס של 1:100 בשמונה בקבוקים של 250 mL.
3. סמנו את הבקבוק הראשון כ-"un-induced" (לא מושרה) ואת השאר כ-"induced" (מושרים), יחד עם נקודות הזמן שבהן יש לאסוף כל דגימה (למשל, "induced t = 0", "induced t = 10 min", "induced t = 20 min" וכו'; (איור 1).
4. לאחר 90 דקות של דגירה, כאשר ה-OD (צפיפות אופטית) 600 היא בין 0.1–0.2, או בזמן של השראה ספונטנית מינימלית (ראו את הדיון), הוסיפו 4 µL של חומצה אצטית קרחית 1% (v/v) לבקבוק ה-un-induced (איור 1).
   הערה: מכיוון שחומר ההשראה בעבודה זו הוכן תוך שימוש בחומצה אצטית קרחית 1% כממס, נוספה אותה כמות של ממס לבדו כשלב בקרה. ניתן לשקול בקרות חלופיות בהתאם להכנת חומרי השראה שונים.
5. הוסיפו את תרבית ה-80 mL מהבקבוק ה-un-induced ל-720 mL של LB סטרילי, והוסיפו מיד את תמיסת העצירה (פנול 5% [v/v] קר, pH 4.3, אתנול 95% [v/v]) בנפח המהווה 20% מנפח התרבית (160 mL), ודגרו על קרח למשך מינימום 30 דקות ולא יותר מ-2 שעות כדי לייצב את תמלילי ה-RNA. זוהי הדגימה הבלתי-מושרהה.
6. השרו את שאר התרביות בשבעה בקבוקים של 250 mL (איור 1) באמצעות ה-FMIC (ריכוז עיכוב מינימלי סופי) של חומר השראה מתאים (במקרה זה, 25 mg·mL−1 norfloxacin, שהוכן בחומצה אצטית קרחית 1% [w/v], שנעשה בו שימוש בריכוז סופי של 1 µg·mL−1), ערבבו היטב, ודגרו ב-37 °C עם ניעור ב-180 rpm למשך שעה אחת.
   הערה: שלב זה יאלץ את תרבית הליסוגן למצב מתואם יותר של רפליקציה ליטית. רוב התאים בתרבית יתחילו לעבור ייצור ליטי של חלקיקי פאג זיהומיים.
7. אפשרו לתאים להתאושש על ידי הוספת 80 mL של תרבית מהבקבוק המושרה ל-720 mL של LB סטרילי, מה שמדלל ביעילות את חומר ההשראה. אספו את התאים הבקטריאליים מכל בקבוק כל 10 דקות מזמן 0 ועד שעה אחת על ידי הוספת תמיסת עצירה, כפי שצוין בשלב 1.5.
   הערה: תמיסת העצירה מייצבת את ה-RNA למשך עד שעתיים. עם זאת, כדי לשפר את יציבות הדגימה, בצעו את כל השלבים הבאים ב-4 °C.
8. אספו את התאים על ידי סבוב (centrifugation) ב-10,000 x g למשך 15 דקות ב-4 °C בהקדם האפשרי, ולאחר זמן שלא יעלה על שעתיים מהטיפול כדי למנוע פירוק של ה-RNA.
9. שפכו את הנוזל העליון (supernatant), ותלו את משקעי הבקטריות בעדינות בנוזל שנותר באמצעות פפיטה אוטומטית מתכווננת לפני העברת כל דגימה למיקרו-צנטריפוגה של 1.5 mL.
10. סובבו את מבחנות המיקרו-צנטריפוגה במהירות גבוהה (13,000 x g) במיקרו-צנטריפוגה ב-4 °C למשך דקה אחת, ושפכו את הנוזל העליון שנותר.
11. הקפיאו במהירות (Flash-freeze) את המשקעים על ידי טבילת כל מבחנת מיקרו-צנטריפוגה אטומה בחנקן נוזלי. דבר זה יסייע לליזיס יעיל של התאים לצורך מיצוי RNA.
12. הוסיפו TRIzol (1 mL) לכל משקע קפוא, והומוגניזו את התרחיף באמצעות פפיטה (אין להשתמש ב-vortex). אחסנו ב-−80 °C עד למועד ביצוע מיצוי ה-RNA עבור כל הדגימות.
    הערה: ניתן להשהות את הפרוטוקול בנקודה זו.
13. חזרו על שלבים 1.1–1.13 עם שלוש חזרות ביולוגיות.

תוצאות

איור 1: התכנון הניסויי לדגימה של תרביות מושרות ולא מושרות לצורך בידוד RNA.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה

שם	חברה	מספר קטלוג	הערות
פאגי LES	הודו וטוהרו מ-LESB58 באמצעות Norfloxacin.	מחקר זה
Lysogeny Broth (LB)	Merck	1.10285.500
Agar Lysogeny Broth (LB)	Merck	1.10283.500
Agar Agar	Fisher	A/1080/53
Top Agar	0.4 g Agar Agar + 2.5 g LB Broth ב-100 mL מים; לעקר באוטוקלאב ולהשתמש.	-
Rifampicin	Sigma (מלאי: 50 mg/mL ב-Methanol - לערבב היטב ולהשתמש במסנן 0.22µm לסטריליזציה ולאחסון ב-20°C- עד לשימוש)	R3501
חומצה אצטית קרחונית	Fisher 1% (v/v) במים	10060000
Norfloxacin	Sigma (מלאי: 25 mg/mL ב-1% חומצה אצטית קרחונית - לערבב היטב ולהשתמש במסנן 0.22µm לסטריליזציה ולאחסון ב-20°C- עד לשימוש; כדי למנוע מחזורי הפשרה והקפאה, לאחסן כ-aliquotes קטנות)	N9890
פנול רווי בבופר ציטראט pH 4.3	Sigma	P-4682
אתנול בדרגת ביולוגיה מולקולרית	Fisher	16695992
TRIzol	Invitrogen	12044977
כלורופורם	Fisher	11398187
איסופרופנול	Fisher	17150576
מים ללא נוקלאז	Invitrogen	10526945