משלוח ישיר של MIF Morpholinos Into Otocyst דג הזברה על ידי הזרקת electroporation משפיעה על פיתוח האוזן הפנימית

סיכום

שיטה כדי לספק morpholinos ישירות otocyst דג הזברה ב 24hpf פותחה. שימוש microinjection של morpholinos לתוך לומן של שלפוחית ​​otic ו electroporation אפקט חדירה, הצלחנו לעקוף את ההשפעה של morpholinos על המוח ולקבל השפעות ספציפיות באוזן הפנימית.

תקציר

בשנים האחרונות, electroporation הפך טכניקה פופולרית ב transfection vivo של DNA, RNA, ו morpholinos לתוך רקמות שונות, כולל העין, המוח, somites של דג הזברה. היתרון של electroporation על פני שיטות אחרות של מניפולציה גנטית היא כי רקמות ספציפיות יכול להיות ממוקד, הן במרחב ובזמן, המבוא של מקרומולקולות על ידי יישום של זרם חשמלי. כאן אנו מתארים את השימוש electroporation עבור transfecting MIF ו-MIF כמו morpholinos לתוך הרקמות של האוזן הפנימית בפיתוח של דג הזברה. במחקרים שנעשו בעבר, MIF morpholino מוזרק עוברים על 1 - לשלב 8-cell הביא שינויים מורפולוגיים נרחבת במערכת העצבים העין, כמו גם את האוזן. על ידי מיקוד הרקמות של האוזן הפנימית בשלבים מאוחרים יותר בהתפתחות, אנו יכולים לקבוע את ההשפעות העיקריות של MIF באוזן הפנימית מתפתחות, לעומת השפעות משניות שעלולים לנבוע להשפיע על רקמות אחרות. באמצעות טובולין phalloidin ו acetylated מכתים ללמוד את המורפולוגיה של נוירונים, תהליכים עצביים, ותאי השיער הקשורים המקולה האחורי, היינו מסוגלים להעריך את היעילות של electroporation כשיטה transfection ממוקד באוזן הפנימית דג הזברה. שלפוחית ​​otic עוברים 24hpf הוזרקו morpholinos ו electroporated ו הושוו העוברים כי לא קיבל שום טיפול או היה מוזרק רק או electroporated. עוברים כי הוזרקו ו electroporated נרשמה ירידה במספר התאים שיער, ירידה העצבוב של הגנגליון statoacoustic (SAG) ו נוירונים SAG פחות בהשוואה לקבוצות הבקרה. התוצאות שלנו הראו כי משלוח ישיר של morpholinos לתוך otocysts בשלבים מאוחרים יותר ימנע את המערכת הלא ספציפית העצבים ואת ההשפעות של הרכס העצבי morpholinos נמסר בשלב 1-8 התא. זה גם מאפשר בדיקה של השפעות מכוונות לאוזן הפנימית ולא השפעות משניות על האוזן מפני ההשפעות העיקרית על המוח, רכס עצבי או mesenchyme periotic.

פרוטוקול

1. ביצוע אלקטרודות עבור electroporation

1. גזור בקוטר 75 מיקרומטר תיל טונגסטן (AM Systems, Inc Carlsborg, WA) באורך המתאים (כ 3-5 ס"מ)
2. שימי חוט טונגסטן באמצעות Molex מחבר כבל (נחושת חותמת פינים)
3. טונגסטן גלישת חוטים כבל Molex עם צינורות להתכווץ (SPC וטכנולוגיה, שיקגו, אילינוי) ולהחיל חום עם מבער בונזן או אקדח חום לאטום את צינורות מתכווץ לחוט
4. כדי לחדד את קצה חוט טונגסטן, לטבול את החוט לתוך סודיום הידרוקסיד N 1.0 (קונרד et al. 1993), באמצעות מהדק נייר כמו אלקטרודה שני, electrolyze את החוט עם Electroporator גל סקוור. התנאים בהם אנו משתמשים הם 5 50 וולט פולסים לאורך כל 100 מילישניות עם 50 ms בין פולסים. אלקטרודות צריך להיות מחודד בקוטר של 15-20 מיקרומטר
5. שמור את החוטים מגש בתוך חריצים דחוק פלסטלינה לפני השימוש ב electroporation

2. הגדרת תחנה electroporation

1. Tape חידד 75μm אלקטרודות טונגסטן עד micromanipulators (Precision מכשירים העולמי).
2. המקום micromanipulators משני צדי הבמה מיקרוסקופ לנתח (לייקה).
3. חיבור אלקטרודות Electroporator CUY-21 הגן ערוך גל ריבועי (איור 1).
4. הפעל electroporator ולהקים פרמטרים electroporation, כולל מתח, משך הדופק, ומספר פולסים. הפרמטרים היעיל ביותר בניסוי זה נמצאו להיות שלושה 13 וולט פולסים אשר כל אחד נמשך 5.0ms, עם 100ms בין הדופק בכל. אם electroporation יוצר בועות אוויר בעובר, להפחית את אורך הפולס.

3. Microinjection של Morpholinos לתוך שלפוחיות Otic דג הזברה

1. דג הזברה קציר עוברים מטנק הרבייה. דגירה עוברים בעובר העלאת בינוני עם 0.3 PPM מתילן כחול (Westerfield, 2005) על 28.5 מעלות צלזיוס למשך הלילה.
2. משוך מחטים זכוכית עם חולץ סאטר P-97 אלקטרודה
3. חימום ג'ל agarose הבסיס (1% agarose במים דגים צלחת פטרי 10 מ"מ) עד 37 מעלות צלזיוס באמבט מים
4. מחממים 1% נמוך נקודת התכה agarose (LMPA) דג במים עד נמס לשמור אותו חם האמבטיה במים 37 מעלות צלזיוס.
5. מלא מחט זכוכית עם פתרון morpholino (GeneTools, Corvallis, OR) וחתך את קצה לקוטר המתאים. הר את המזרק על micromanipulator (קון).
6. חותכים קצה המחט כ 10 מיקרומטר ו להזריק לתוך שמן מינרלי על מנת להבטיח כי קצה מאפשרת העברת מספקת פתרון morpholino.
7. Dechorinate עוברים על postfertilization שעות 24 (hpf) ו להרדים אותם עם MS222 (tricaine, Sigma) ב 0.3 מתילן מים PPM דגים כחולות.
8. יישר 3-5 עוברים בהרדמה על בסיס ג'ל agarose עם בצד ימין למעלה לניתוח אחיד ונוח
9. שימי 1-2 טיפות LMPA 1% מעל כל העובר ולתת לחזק לתקן את העובר במקום
10. סובב את צלחת פטרי כך שלפוחית ​​otic הוא בצד ימין
11. מניחים את המחט לתוך לומן של שלפוחית ​​otic ו להזריק את הפתרון morpholino עם PV820 פניאומטיים PicoPump (מכשירים העולם Precision) עם מיכל חנקן המצורפת (איור 2)

4. Electroporation נוהל

1. הזז את העוברים רכוב לתחנת electroporation מיד לאחר ההזרקה
2. מניחים את האלקטרודה החיובית על רקמות האחורי רק כדי שלפוחית ​​otic, אבל לא לחדור; להכניס את האלקטרודה השלילית אל המוח הקדמי רק כדי שלפוחית ​​otic
3. החל הנוכחי באמצעות דוושת רגל או על ידי לחיצה על מתג.
4. יוצקים מים ודגים על agarose ולהסיר עוברים מן agarose עם מתערבלים פיפטה מזכוכית. היזהר לא לפגוע בעוברים. עבור עוברי שקשה להסיר להשתמש מחט בעדינות להתנתק כל LMPA המקיפים את העובר.
5. המקום עוברים בצלחת עם מים מתילן כחול דגים להעלות את העוברים לשלבים הרצוי לניתוח (מורפולוגיים, immunohistochemical, באתרו anlaysis, הכלאה וכו מיקרוסקופיים).

5. נציג תוצאות:

באיור 1. לתחנת electroporation. אלקטרודות נעשו באמצעות חידד חוטי טונגסטן 75μm ומחובר על ידי מוביל Electroporator CUY-21 הגן על גל כיכר עריכה. אלקטרודות אלה היו מודבק micromanipulators.

איור 2. לתחנת הזרקה. עוברים כל הוזרקו האוזן הימנית למטרות תקינה.

3. איור Phalloidin מכתים של סיבי אקטין עם 3 עוברים DPF. (א) העובר injecte 3 DPFד עם שליטה MO יש כתמים חזקים של phalloidin ב המקולה האחורי (PM). (ב) העובר אשר מוזרק עם שליטה MO ואז electroporated היו רמות דומות של מכתים phalloidin ב pm ב עוברים בהזרקה בלבד. (ג) הזרקה עם MIF MOS לתוך שלפוחית ​​otic לבד לא גרם לירידה של מכתים phalloidin, תוך הזרקה של MIF MOS יחד עם electroporation גרם לירידה דרמטית של מכתים phalloidin ב pm (ד '). בבוקר, קדמית המקולה.

איור 4. מכתים Phalloidin של סיבי אקטין עם זחלים 5 DPF. לא היה הבדל בין זריקה בלבד (A) עם הזרקת electroporation כאשר רמת השליטה morpholino שימש (B). עם זאת, הזחלים 5 DPF כי הוזרקו MIF morpholinos ו electroporated הראה מופחת מכתים phalloidin ב המקולה האחורי (pm) (ד), אם כי פחות דרמטית DPF 3, בהשוואה לעובר כי הזריקו MIF morpholinos בלבד (C ). בבוקר, קדמית המקולה.

איור 5. מכתים טובולין Acetylated של עוברים ב DPF 3. העובר ב (א) לא קיבלו שום זריקה או electroporation. העובר ב (ב) היה electroporated אבל לא קיבל זריקה. שניהם עוברים קבלת הזריקה electroporation (C, D) עם MIF morpholinos היה בעליל מכתים טובולין פחתה בהשוואה לקבוצת הביקורת. (המקולה pm האחורי).

איור 6. מכתים טובולין Acetylated של עוברים ב DPF 3 עם שליטה morpholino. (א) העובר ללא כל טיפול הראו טובולין חזקה מכתים acetylated ב המקולה האחורי (PM) וכן עצבוב רב. (ב) העובר מוזרק עם שליטה morpholino. (ג) העובר שטופלו electroporation בלבד. (ד) העובר בקרה עם שליטה morpholino הזריק electroporated יש רמות דומות של טובולין acetylated ב המקולה העצבוב האחורי והשווה לשלוט ללא טיפול.

דיון

יש לנו הציג בהצלחה oligonucleotide MOS antisense לתוך האוזן של העובר hpf 24 דג הזברה. עוברים שהועלו לאחר ההזרקה ואת electroporation היו קיימא. אם העוברים שרדו את electroporation, הם גדלו בקצב נורמלי לעומת עוברי כי לא קיבל שום טיפול, כמו גם העוברים שהיו רק מוזרק ועוברים שהיו רק electroporated.

ראינו את ההשפעות של MIF ו-MIF כמו חודש לאחר ההזרקה האוזן electroporation באמצעות תיוג עם phalloidin ו טובולין acetylated. מכתים Phalloidin של סיבי אקטין בתאי השיער חושית של המקולה האחורי עולה כי electroporation של MIF ו-MIF כמו MO בשלב 24-hpf גרמה לשינויים בתא שיער ו / או מספרי stereocilia בהשוואה עוברי כי הוזרקו רק עם MOS (איור 3). ירידה זו במספר התא שיער עולה בקנה אחד עם הממצאים של שן et al. (שהוגשו) כי MOS כדי MIF ו-MIF כמו גרם לירידה במספר התאים שיער המקולה saccular. הירידה במספרים תא שיער עוברי כי הוזרקו MOS ו electroporated להוכיח כי electroporation עשוי לסייע בהעברת MOS על פני קרום התא, ובכך להגדיל את היקף ההשפעה המורפולוגית בהשוואה עוברים בו שלפוחית ​​otic שהוזרק בלבד. שינויים במורפולוגיה של הגנגליון statoacoustic נצפו באמצעות מכתים טובולין acetylated. מידת העצבוב של הגנגליון statoacoustic הושפע, כמו עוברי כי הוזרקו ו electroporated להראות ירידה הסתעפות של neurites (איור 5). כמו כן יכול להיות ירידה התעבות של תאים ganglionic ו / או מספר קטן של תאים הגנגליון, כי מכתים טובולין acetylated היא ירדה משמעותית עוברים כי היו שניהם הזריק electroporated. מכיוון MIF הוכח להיות קריטי להתפתחות מערכת העצבים (סוזוקי et al. 2004), ראו את השינויים לאחר electroporation עשוי להיות תוצאה של transfection מוגברת של MIF ו-MIF כמו פתרון MO לתוך התאים neuroblast.

Electroporation של antisense אוליגו morpholinos ישירות לתוך רקמות מתפתחת הוא כלי שימושי לבקרת ביטוי של גנים במהלך ההתפתחות זה רקמות, הן במרחב ובזמן, בעובר. Electroporation של MIF ו-MIF כמו Mos לתוך הרקמות של האוזן הפנימית הביא מורפולוגיה תקינה של המקולה הן האחורי ואת הגנגליון statoacoustic. היתה ירידה במספר התאים שיער חושית המקולה האחורי בעוברים שהיו מזריקים ו electroporated בהשוואה עוברי כי לא קיבל שום טיפול או עם עוברים אשר גם היה מוזרק רק או electroporated בלבד. הייתה גם ירידה במידת העצבוב התיקון חושית האחורי של הגנגליון statoacoustic וגודל SAG. Electroporation היא שיטה ערך עבור transfecting מקרומולקולות לתוך רקמות ספציפיות, עם יתרון של התבוננות ההשפעות העיקריות של ה-DNA מסוים, RNA, או MO ברקמות הרצוי להפלות בין אלה השפעות משניות על ברקמות אחרות, כולל המוח, ציצה עצביים mesenchyme periotic על התפתחות האוזן הפנימית (Barald וקלי, 2004).

חומרים

1. MOS: 0.3 מ"מ עבור שילוב של MIF, MIF כמו MO1, ו-MIF כמו MO2 היה בשימוש.
   MIF MO הוא משלים קודון ההתחלה של mRNA MIF דג הזברה: 5'-acatcggcatgactgcgacagagat-3 ". שני MOS שימשו MIF כמו MIF כמו MO1 היא חינם לאתר להתחיל translational:. 5'-GTTTCTATATTTATGAACGGCATGA-3 ', בעוד MIF כמו MO2 נגזר כרצף בגבול intron1/exon 2: 5'-GATTCATCCTCTGAAGACGTAAGCC -3 ". בקרת MO היה רצף נוקליאוטידים מקושקשות מתוך כלים ג'ין: 5'-CCTCTTACCTCAGTTACAATTTATA-3 ".
2. מתילן כחול (0.3 ppm) מים ודגים
3. MS222 (tricaine, Sigma, 0.64 מ"מ מים דגים)
4. נקודת התכה נמוכה agarose (LMPA; רוש)
5. פנול אדום (Sigma)
6. Anti-acetylated טובולין (Sigma)
7. אלקסה פלואוריד ® 488 אנטי עכבר עז הנוגדן השני (בדיקות מולקולרית)
8. טקסס אדום phalloidin (בדיקות מולקולרית)