איסוף נגיף אדנו-אסוסיאטיבי (AAV) מתאי יונקים שעברו טרנספקציה

תקציר

קציר AAV (נגיף אדנו-אסוציאטיבי) וליזיס כימית של תאי HEK293 (תאי כליה עובריים אנושיים 293) שעברו טרנספקציה. נער את תא תרבית התאים בעוצמה כדי לשחרר את התאים עד שהמדיום נראה עכור מהתאים ששוחררו, ומזוג לארבעה מבחנות צנטריפוגה של 500 מ"ל. צנטריפוג את המבחנות במהירות של 18,000 x g למשך 30 דקות בטמפרטורה של 4 °C כדי לשקע את התאים. מזוג את העלייה המזוקקת לבקבוק PETG (פוליאתילן טרפתלאט קופוליאסטר) בנפח של 1 ליטר. הערה: אם אין גישה לצנטריפוגה מהירה, בצע צנטריפוגה במהירות של 12,000 x g למשך 40 דקות. ייתכן שהמשקע של התאים לא יהיה מוצק במהירות זו והוא עלול להחליק בעת מזיגת העלייה. השהה מחדש את משקעי התאים במבחנות צנטריפוגה של 500 מ"ל עם 50 מ"ל של באפר ליזיס והדגר למשך 60 דקות בטמפרטורה של 37 °C. צנטריפוג את המבחנות במהירות של 18,000 x g למשך 30 דקות, ולאחר מכן העבר את העלייה לאותו בקבוק PETG של 1 ליטר. השלף את שאריות התאים ששקעו. הערה: טהר את העלייה המזוקקת באופן מיידי ואחסן בטמפרטורה של 4 °C למשך עד 72 שעות. לאחסון לטווח ארוך יותר, אחסן בטמפרטורה של 80 °C-. אין לאחסן בטמפרטורה של 20 °C-. .Rghei, A. D ואחריםייצור וקטורים של וירוס אדנו-אסוצייטיבי (Adeno-Associated Virus) בתרביות תאים בשכבות למחקרים פרה-קליניים במודלים של בעלי חיים גדולים. .J. Vis. Exp (2021)

סרטון זה מדגים את השחזור של נגיף adeno-associated virus גולמי מתאי יונקים שעברו טרנספקציה באמצעות ליזיס כימי וסנטריפוגציה, מה שמאפשר ייצור AAV בתנובה גבוהה לצורך טיהור בהמשך וליישומים של טיפול גנטי פרה-קליני.

פרוטוקול

1. קציר AAV (נגיף אדנו-אסוסיאטיבי) וליזיס כימי של תאי HEK293 (תאי כליה עובריים של בן אדם 293) שעברו טרנספקציה

1. נער את תא תרבית התאים בעוצמה כדי לשחרר את התאים, עד שהתווך ייראה עכור מהתאים שהשתחררו, ומזוג לארבעה מבחנות צנטריפוגה של 500 mL.
2. סובב את המבחנות בצנטריפוגה במהירות של 18,000 x g למשך 30 min בטמפרטורה של 4 °C כדי לשקע את התאים. מזוג את העליון המזוכה לבקבוק פוליאתילן טרפתלאט קופוליאסטר (PETG) בנפח של 1 L.הערה: אם אין גישה לצנטריפוגה מהירה, סובב בצנטריפוגה במהירות של 12,000 x g למשך 40 min. ייתכן שהמשקע התאי לא יהיה מוצק במהירות זו ויחליק בעת מזיגת העליון.
3. שחזר את משקעי התאים במבחנות צנטריפוגה של 500 mL עם 50 mL של באפר ליזיס (lysis buffer) והדגר למשך 60 min בטמפרטורה של 37 °C.
4. סובב את המבחנות בצנטריפוגה במהירות של 18,000 x g למשך 30 min, ולאחר מכן העבר את העליון לאותו בקבוק PETG של 1 L. השליך את שיירי התאים ששקעו.הערה: טהר את העליון המזוכה באופן מיידי ואחסן בטמפרטורה של 4 °C למשך עד 72 h. לאחסון לטווח ארוך יותר, אחסן בטמפרטורה של -80 °C. אין לאחסן בטמפרטורה של -20 °C.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה

שם	חברה	מספר קטלוג	הערות
10 chamber cellstack	Corning	3271
בקבוק PETG בנפח 1L	Thermo Fisher Scientific	2019-1000
Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) עם 1000 mg/L D-glucose, L-glutamine	Cytiva Life Sciences	SH30022.01
סרום עוברי בקר (FBS)	Thermo Fisher Scientific	SH30396.03
תאי HEK293	American Tissue Culture Collection	CRL-1573	עם קבלת התאים, יש להפשיר אותם ולגדל אותם לפי פרוטוקול היצרן. לאחר שהתאים עברו מספר מינימלי של מעברים וגדלים היטב, יש להקפיא תת-דגימה בעתיד במנות (aliquots) ולאחסן בחנקן נוזלי. יש להשתמש תמיד בתאים שמספר המעברים שלהם נמוך מ-30. לאחר שתאי התרבית עברו יותר מ-30 מעברים, מומלץ להתחיל תרבית מחדש מהמנות המאוחסנות
כרית תמיכה למבחנות צנטריפוגה לנפח גדול	Corning	CLS431124	יש להשתמש בכרית תמיכה עם מבחנות צנטריפוגה לנפח גדול, אלא אם לרוטור הצנטריפוגה יש כריות בעלות תחתית V מתאימה
מבחנות צנטריפוגה לנפח גדול	Corning	CLS431123-6EA	מבחנות צנטריפוגה בנפח 500 mL