טיהור של וקטורים של נגיף אדנו-אסוציאטיבי (AAV) באמצעות כרומטוגרפיית זיקה

תקציר

מקור: Rghei, A. D., ואחריםייצור של וקטורים של נגיף אדנו-אסוסיאטיבי (AAV) במגשיי תרבית רב-שכבתיים (Cell Stacks) עבור מחקרים פרה-קליניים במודלים של בעלי חיים גדולים. J. Vis. Exp. (2021)

הסרטון מדגים טיהור של וקטורי נגיף אדנו-אסוסיאטיבי (AAV) רקומביננטיים מליזט גס של תאי המאחסן באמצעות מטריצת זיקה מבוססת הפרין. חלקיקים נגיפיים נקשרים להפרין שאינו נייד, בעוד שזיהומים נשטפים החוצה. בופר בעל ריכוז מלח גבוה משחרר נגיפים שלמים, אשר נאספים בפרקציות מועשרות. פרקציות אלו מרוכזות באמצעות סבוב צנטריפוגלי של ממברנה ונשטפות כדי להחזיר חלקיקים שנותרו, ובכך מופקים וקטורי AAV מטוהרים בעלי תיתר גבוה.

פרוטוקול

1. טרנספקציה כפולה של פלסמידים לתאי HEK293 במערכות תאי Stack

1. הפשיר מבחנה קריוגנית של תאי כליה עובריים אנושיים 293 (HEK293) באמבט חרוצים המכוון ל-37 °C.
   הערה: חמם מראש מצע DMEM (Dulbecco’s Modified Eagle Medium) מלא ל-37 °C בזמן הפשרת התאים כדי למנוע הלם קור במהלך הזריעה. ודא שלתאים יש מספר מעברים נמוך, רצוי פחות מ-20, כדי להבטיח צמיחה ויעילות טרנספקציה מיטביות. ודא שהתאים מאושרים כנקיים ממיקופלסמה.
2. העבר את תוכן המבחנה הקריוגנית בטיפות למבחנה קונית של 15 mL המכילה 10 mL של DMEM מלא מחומם מראש, וסבב את התאים בצנטריפוגה ב-500 × g למשך 5 min.
3. שאב את המצע, ולאחר מכן השהה מחדש את תאי ה-HEK293 ב-20 mL של DMEM מלא מחומם מראש. זרע את התאים בצלחת של 15 cm והדגר ב-37 °C, עם 5% CO₂.
4. פצל את התאים מצלחת 15 cm אחת לשלוש צלחות לצורך זריעה בתא תרבית התאים.
   1. כאשר התאים מגיעים ל-80% התמזגות (confluency), שאב את המצע ושטוף בעדינות את הצלחת עם 3 mL של סליין עם בופר פוספטי (PBS) כדי לא להפריע לשכבה החד-שכבתית (monolayer). לאחר מכן, שאב את ה-PBS והוסף 3 mL של טריפסין.
   2. הדגר למשך 2 min ב-37 °C עד שהתאים ניתקים מהצלחת, ולאחר מכן נטרל את הטריפסין על ידי הוספת 7 mL של DMEM מלא לצלחת.
   3. אסוף את כל המצע והתאים למבחנה של 15 mL והשק את התאים על ידי סבב בצנטריפוגה ב-500 × g למשך 5 min.
   4. שאב את העלייה (supernatant) מהמבחנה של 15 mL והשהה מחדש את משק התאים ב-3 mL של DMEM מלא. הוסף 1 mL לכל צלחת 15 cm המכילה 20 mL של DMEM מלא; נער את הצלחות בעדינות כדי להפיץ את התאים באופן שווה, והדגר ב-37 °C, עם 5% CO₂.
5. כאשר התאים מגיעים ל-80% התמזגות, חזור על שלבים 1.4.1 ו-1.4.2. אסוף את העלייה למבחנות קוניות של 50 mL, והפוך את המבחנה בעדינות כדי להבטיח שהתאים הומוגניים.
6. קבע את צפיפות התאים על ידי ערבוב של 10 µL מדגימות התאים עם 10 µL של trypan blue והוספת התערובת לסלייד ספירת תאים לצורך ניתוח בסופר תאים.
7. ערבב 1 L של DMEM מלא מחומם מראש עם תרחיף התאים הדרוש כדי לזרע את תא תרבית התאים (שטח פנים של 6360 cm²) בריכוז של 1 × 10⁴ תאים/cm². שפוך את תערובת התאים לתוך תא תרבית התאים וסובב בעדינות כדי להפיץ את התאים באופן שווה על פני כל שכבה חד-שכבתית (איור 1) והדגר ב-37 °C, עם 5% CO₂.
8. בנוסף לתא תרבית התאים, זרע צלחת 15 cm בריכוז של 1 × 10⁴ תאים/cm² כביקורת להתמזגות.
9. לאחר הדגרה של כ-65 שעות, בדוק את צלחת הביקורת לאחוזי התמזגות – באופן אידיאלי כ-80%-90% התמזגות.
   הערה: חמם מראש DMEM מלא ל-37 °C לפני הוספתו לתא תרבית התאים.
10. הכן תערובת פוליאתילן-אימין (PEI)/DNA ביחס ריכוזים של 3:1 (משקל/משקל).
    1. הכן את תערובת ה-DNA במבחנה קונית של 50 mL על ידי הוספה של 475 µg של pTrangene ו-1425 µg של pHelper ל-40 mL של מצע עם סרום מופחת כדי ליצור יחס של 3:1 בין pHelper ל-pTrangene.
       הערה: ניתן למצוא את מחשבון תערובת ה-PEI/DNA באמצעות טבלה 1.

טרנספקציית תאית תרבית
פרוטוקול
1. יש להמתין עד ש-DNA, OptiMEM ו-PEI יגיעו לטמפרטורת החדר לפני הטרנספקציה
2. הזן את מספר מחסניות התאים (cell stacks) המיועדות לטרנספקציה (אין צורך בכמות עודפת)
3. ודא שריכוזי ה-DNA נכונים, שכן הדבר ישנה את הנפחים הנדרשים
מספר תאי תרבית		1
ריכוז פלסמיד transgene		1	mg/mL
ריכוז פלסמיד pDGM6.2FF		1	mg/mL
		כמות לכל תא תרבית		תערובת מאסטר לטרנספקציה (Transfection Mastermix)
	OptiMEM	48.1	mL	48.1	mL
יחס 1:3 pTransgene:pHelper	pTransgene	475	µg	475	µL
	pHelper	1425	µg	1425	µL
4. הוסף את הנפחים הנדרשים של OptiMEM ו-DNA פלסמידי לשפופרת קונית של 50 mL
5. הפוך את השפופרת 10 פעמים לערבוב
יחס 3:1 PEI:DNA	PEI Max	5.7	mL	5.7	mL
6. הוסף את הכמות הנדרשת של PEI לשפופרת ה-50 mL המכילה את ה-OptiMEM וה-DNA הפלסמידי
7. סגור מיד את שפופרת ה-50 mL, ובצע ערבוב באמצעות וורטקס והפיכה של 3–5 פעמים.
8. הפעל טיימר ל-10 דקות לאינקובציה של קומפלקסי ה-PEI
9. העבר את מחסניות התאים המיועדות לטרנספקציה לקבמינה ביולוגית (BSC)
10. לאחר 10 דקות, שפוך את תערובת הטרנספקציה לתוך פתח כתום אחד.
11. ערבב בעדינות את הנוזל לאורך כל מחסנית התאים
12. החזר את מחסנית התאים שעברה טרנספקציה לאינקובטור, תוך וידוא של נפח שווה בכל שכבה
13. קצור את תא התרבית לאחר 72 שעות

טבלה 1: מחשבון טרנספקציה לתא תרבית. גיליון עבודה אינטראקטיבי לקביעת הריכוז הנכון של pTransgene, pHelper ו-PEI עבור טרנספקציה של תא תרבית.

2. הוסף 5.7 mL של PEI (1 g/L) למצע עם סרום מופחת ולתערובת ה-DNA בטפטוף. לאחר מכן, ערבב קצרות ב-vortex והדגר למשך 10 min בטמפרטורת החדר.
הערה: במהלך הדגרת ה-PEI/DNA בטמפרטורת החדר, התמיסה תהפוך למעט עכורה.

11. לאחר 8 דקות של דגירה של PEI/DNA, הוצא את המצע מתא תרבית התאים.
    הערה: ודא כי שני הפקקים הכתומים שחררו כדי לשמור על זרימה חלקה של המצע ולמנוע תלישה של תאים.
12. הוסף את ה-PEI/DNA ל-1 L של DMEM מלא שחומם מראש, ושפוך לאט את התערובת לתוך פתח תא תרבית התאים. פזר את הנוזל באופן שווה לכל השורות (איור 1) ודגור למשך 72 h ב-37 °C, עם 5% CO₂.

2 קציר של נגיף אדנו-אסוסיאטיבי (AAV) וליזיס כימי של תאי HEK293 שעברו טרנספקציה

1. נער את תא תרבית התאים בעוצמה כדי לשחרר את התאים, עד שהמדיום נראה עכור מהתאים שהשתחררו, ומזג לארבעה מבחנות צנטריפוגה של 500 mL.
2. בצע צנטריפוגה למבחנות ב-18,000 × g למשך 30 min ב-4 °C כדי להשקיע את התאים. מזג את supernatant המזוקק לבקבוק polyethylene terephthalate copolyester (PETG) של 1 L.
   הערה: אם אין גישה לצנטריפוגה במהירות גבוהה, בצע צנטריפוגה ב-12,000 × g למשך 40 min. ייתכן שהתאים שהשקיעו לא יהיו מוצקים במהירות זו והם עלולים להחליק בעת מזיגת ה-supernatant.
3. השבה את משקעי התאים (pellets) במבחנות צנטריפוגה של 500 mL עם 50 mL של lysis buffer והדגר למשך 60 min ב-37 °C.
4. בצע צנטריפוגה למבחנות ב-18,000 × g למשך 30 min, ולאחר מכן העבר את ה-supernatant לאותו בקבוק PETG של 1 L. השלף את פסולת התאים שהשקיעה.
   הערה: טהר את ה-supernatant המזוקק באופן מיידי ואחסן ב-4 °C למשך עד 72 h. לאחסון לטווח ארוך יותר, אחסן ב-80 °C-. אין לאחסן ב-20 °C-.

3 טיהור וקטור AAV באמצעות כרומטוגרפיית זיקה להפרין

1. הוצא את הליזאט הגולמי מ-80 °C והשאר ב-4 °C למשך הלילה להפשרה. לאחר ההפשרה, השתמש במסנן של 0.22 µM כדי לסנן את הליזאט הגולמי.
2. כדי לבצע פסיבציה למרכז הצנטריפוגלי, הוסף 4 mL של בופר לקדם-טיפול של מסנן למרכז צנטריפוגלי עבור כל עמודת heparin sepharose שבה נעשה שימוש. בצע פסיבציה של המרכז הצנטריפוגלי בטמפרטורת החדר למשך 2-8 שעות. הגדר את הפסיבציה מיד לפני שלבי הטיהור.
3. הכן את הצינורות ואת המשאבה (איור 2).
   1. הנח את הצינורות במשאבה פריסטלטית והעבר 20 mL של 1 M NaOH. לאחר מכן, העבר 50 mL של מים בדרגה מולקולרית, ולאחר מכן העבר 50 mL של basal DMEM.
   2. חבר עמודת heparin sepharose של 5 mL לצינורות והעבר 25 mL של basal DMEM כדי להסיר את חומר השימור.
4. העבר 0.2 µM של הליזאט הגולמי המסונן דרך העמודה בקצב זרימה של 1-2 טיפות/שנייה.

הערה: יש לוודא שלא נוצרו בועות או שהעמודה לא התרוקנה מנוזלים, שכן הדבר יפגע בעמודה וימנע את אלוציית ה-AAV. יש להשליך את העמודה אם היא התרוקנה מנוזלים ולהשתמש בעמודה חדשה עבור שאר הליזאט הגולמי.

5. העמסו את כל הליזאט הגולמי על עמודת ההפרין והשתמשו בתמיסות הבאות לשטיפת העמודה.
   1. שטפו באמצעות 50 mL של 1× Hank's Balanced Salt Solutions (HBSS) ללא Mg²⁺ ו-Ca²⁺.
   2. שטפו באמצעות 15 mL של 0.5 % N-Lauroylsarcosine ב-HBSS ללא Mg²⁺ ו-Ca²⁺.
   3. שטפו באמצעות 50 mL של HBSS ללא Mg²⁺ ו-Ca²⁺.
   4. שטפו באמצעות 50 mL של HBSS עם Mg²⁺ ו-Ca²⁺
   5. שטפו באמצעות 50 mL של 200 mM NaCl/HBSS עם Mg²⁺ ו-Ca²⁺.
   6. בצעו אלוציה של 5 × 5 mL (סה"כ 25 mL) עם 300 mM של NaCl/HBSS עם Mg²⁺ ו-Ca²⁺ וסמנו את האלואציות כ-E1-E5 (כל אלואציה היא בנפח של 5 mL).
6. ריכוז הווירוס באמצעות מרכז צנטריפוגלי
   1. סובבו את המרכז הצנטריפוגלי המכיל את תמיסת הקדם-טיפול ב-900 × g למשך 2 min. השליכו את התסנין (flow-through).
   2. שטפו את מסנן המרכז הצנטריפוגלי עם 4 mL של HBSS עם Mg²⁺ ו-Ca²⁺ וסובבו בצנטריפוגה ב-1000 × g למשך 2 min; השליכו את התסנין.
   3. הוסיפו את האלואציה E2 למרכז הצנטריפוגלי. סובבו ב-1000 × g למשך 5 min והשליכו את התסנין.
   4. סיימו להוסיף את E2 ולאחר מכן הוסיפו את E3 למרכז הצנטריפוגלי וסובבו ב-1000 × g למשך 5 min עד שנפח הווירוס המרוכז יהיה בערך 1 mL.
      הערה: הימנעו מצנטריפוגציה של הווקטור עד לנפח הנמוך מגובה המסנן. אין לרכז את E1, E4 או E5 במרכז הצנטריפוגלי, שכן הם מכילים מעט מאוד ווקטור או שאינם מכילים ווקטור כלל, ומכילים מזהמים.
   5. הוציאו את הווירוס המרוכז מהמרכז הצנטריפוגלי באמצעות טיפ מסונן p200 והעבירו אותו למבחנה צנטריפוגלית סטרילית של 1.5 mL.
   6. שטפו את המרכז הצנטריפוגלי עם 200 µL של HBSS עם Mg²⁺ ו-Ca²⁺ כדי לשחרר שאריות AAV מהמסנן. בצעו פיפטינג (pipette up and down) בעוצמה מספר פעמים (למשך כ-30 s) כדי לשחרר כל וירוס שנדבק לממברנה והעבירו למבחנה הצנטריפוגלית של 1.5 mL יחד עם שאר הווירוס. ערבבו את המבחנה היטב.
   7. הפרידו אליקוט של 5 µL לצורך מיצוי DNA ואחסנו את הווקטור המזוקק ב-80 °C-.
7. שטפו את העמודה באמצעות 25 mL של 2 M NaCl. לאחר מכן, השתמשו ב-25 mL של 0.1% Triton X-100, שחומם מראש ל-37 °C, לשטיפת העמודה. לאחר מכן, שטפו את העמודה באמצעות 50 mL של dH₂O סטרילי, ולאחר מכן שטפו באמצעות 25 mL של 20% ethanol.
8. וודאו שממברנת העמודה רוויה לחלוטין ב-20% ethanol, שכן זוהי תמיסת האחסון. אטמו את העמודה עם הפקקים המסופקים ואחסנו ב-4 °C.
9. אחסנו את הצינורות ב-1 M NaOH.
   הערה: אם ננקו כראוי, ניתן להשתמש בעמודות heparin sepharose עד חמש פעמים.

תוצאות

איור 1: תפעול של מערכת שכבות תאים (cell stack) לזריעת תאים לטרנספקציה. לצורך זריעת תאים במערכת השכבות, התחל בהסרת אחד ממכסי הפיתוח ומזיגה של 1 L של מצע Dulbecco’s Modified Eagle Medium (DMEM) מלא שחומם מראש עם הכמות הנדרשת של תאי HEK293 (A). פזר את התאים והמצע באופן שווה על ידי הידוק שני מכסי הפיתוח, רכז את כל המצע לפינה אחת של מערכת השכבות באמצעות אחד ממכסי הפיתוח והנח אותה בפינה זו (B), הנח את מערכת השכבות על צדה (C), ולאחר מכן סובב את מערכת השכבות ב-90° (D) כך שפתחי הפיתוח פונים כלפי מעלה (E). הורד בעדינות את מערכת השכבות למצב האופקי הרגיל שלה וודא שכל תאי מערכת השכבות מכוסים לחלוטין במצע (F). בעת ביצוע טרנספקציה, פתח את שני מכסי הפיתוח ושפוך לאט את המצע הישן לתוך מכל פסולת סטרילי, תוך שמירה על זרימה אחידה כדי לא להפריע לשכבת התאים (monolayer) (G).

איור 2: הגדרה של משאבה פריסטלטית לטיהור נגיף אדנו-אסוסיאטיבי (AAV). העבירו את הצנרת מהליזאט הגולמי, דרך המשאבה הפריסטלטית, ואל תוך עמודת מטריצת ההפרין.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה

שם	חברה	מספר קטלוג	הערות
0.22 μm סינון	Millipore Sigma	S2GPU05RE
0.25% טריפסין	Fisher Scientific	SM2001C
מערך תאי תאים בעל 10 תאיים (10 Chamber cellstack)	Corning	3271
בקבוק PETG בנפח 1 ליטר	Thermo Fisher Scientific	2019-1000
צלוחיות לתרבית תאים	Greiner bio-one	7000232	צלוחיות בקוטר 15 ס"מ
מבחנה קונית לתרבית	Thermo Fisher Scientific	339650	מבחנה קונית של 15 מ"ל
מבחנה קונוית לתרבית	Fisher Scientific	14955240	מבחנה קונית של 50 מ"ל
מדיום DMEM (Dulbecco's Modified Eagle Medium) עם 1000 מ"ג/ליטר D-גלוקוז ו-L-גלוטמין	Cytiva Life Sciences	SH30022.01
אתנול	גרינפילד	P016EA95	דלל את האתנול (95% נפח) לריכוז של 20% עבור סעיף 3.7.4
סרום עגל עוברי (FBS)	Thermo Fisher Scientific	SH30396.03
תמיסות מלחים מאוזנות של הנק (HBSS) עם Mg²⁺ ו-Ca²⁺	Thermo Fisher Scientific	SH302268.02
תמיסות מלח מאוזנות של הנק (HBSS) ללא Mg²⁺ ו-Ca²⁺	Thermo Fisher Scientific	SH30588.02
תאי HEK293	American Tissue Culture Collection	CRL-1573	עם קבלת התאים, הפשיר אותם וטפח אותם כפי שמתואר בפרוטוקול היצרן. לאחר שהתאים עברו מספר מינימלי של מעברים וגדלים היטב, הקפא תת-מדגם למטרות עתידיות במנות (aliquots) ואחסן בחנקן נוזלי. השתמש תמיד בתאים שמספר מעבריהם נמוך מ-30. ברגע שהתאים המטופחים עברו יותר מ-30 מעברים, מומלץ להתחיל מחדש תרבית מהמנות המאוחסנות.
עמודת הפרין סולפט	Cytiva Life Sciences	17040703
כרית תמיכה לשפופרת צנטריפוגה לנפח גדול	Corning	CLS431124	יש להשתמש בכרית תמיכה עם מבחנות צנטריפוגה בנפח גדול, אלא אם לרוטור הצנטריפוגה יש כריות מתאימות בעלות תחתית בצורת V
מבחנות צנטריפוגה לנפח גדול	Corning	CLS431123-6EA	מבחנות צנטריפוגה של 500 מ"ל
מבחנה למיקרוצנטריפוגה	Fisher Scientific	05-408-129	מבחנה למיקרוצנטריפוגה בנפח 1.5 מ"ל, יש לעקר לפני השימוש
מים בדרגה מולקולרית	Cytiva Life Sciences	SH30538.03
מלח נתרן של N-לאורוילסרקוזין	Sigma Aldrich	L5125	זהירות. יש להשתמש בכפפות
NaCl	Thermo Fisher Scientific	BP35810
Optimem, מצע עם תכולת סרום מופחתת	Thermo Fisher Scientific	31985070
פיפטות פסטור	Fisher Scientific	13-678-20D	יש לעקר לפני השימוש
סליין בבופר פוספט (10x)	Thermo Fisher Scientific	70011044	דלל לריכוז של 1x לשימוש על תאים
תמיסת פניצילין-סטרפטומייצין	Cytiva Life Sciences	SV30010
פלסמיד pHelper	עיצוב דה נובו (De novo) או קבלה ממאגר פלסמידים	לא רלוונטי
אמבטיה לפיפטות	Thermo Fisher Scientific	13-681-502	רכשו אמבטיות סטריליות לפיפטים
פוליאתילן גליקול טרט-אוקטילפניל אתר (Triton X-100)	Thermo Fisher Scientific	9002-93-1	זהירות. יש להשתמש בכפפות
פוליאתילנאימין (PEI)	Polyscience	24765-1	יש לפעול לפי הוראות היצרן להכנת תמיסה בנפח של 1 ליטר. 0.22μm סנן ואחסן ב- 4°C
פלסמיד pTrangene	עיצוב דה-נובו (De novo) או קבלה ממאגר פלסמידים	לא רלוונטי	חייב להכיל SV40 polyA בגנום כדי להיות תואם לבדיקת הטיטר של AAV בסעיף 5.0
צינורית משאבה	Cole-Parmer	RK-96440-14	בצעו אופטימיזציה לאורך הצינוריות ולכלי הכיל של הנגיף בפרקציות E1-E5
נתרן הידרוקסיד (NaOH)	Thermo Fisher Scientific	SS266-4
טריפאן כחול	Bio-Rad	1450021